假单胞菌Pseudomonas khazarica DN-33中的氨同化与多磷酸盐积累:生理表现及基因表达机制研究

《Bioresource Technology Reports》:Ammonia assimilation and polyphosphate accumulation in Pseudomonas khazarica DN-33: Physiological performance and gene expression insights

【字体: 时间:2026年01月08日 来源:Bioresource Technology Reports 4.3

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  氨化聚磷酸盐积累微生物(AA-PAO)Pseudomonas khazarica DN-33的氮磷去除机制及基因调控研究。该菌株在48小时内氨氮去除率达94.31%,基因组显示缺乏硝化基因但含氨同化(glnA)和反硝化(nirA)相关基因,同时具备聚磷酸代谢(ppk、ppx)和磷转运(pstSCAB)基因,高磷氮胁迫下相关基因显著上调,揭示其异养氨同化与反硝化协同作用及代谢可塑性,为废水生物处理提供新菌种。

  
余文豪|文能浩|吴晓波|龙浩|曾艳华|黄爱友|任伟|谢振宇|蔡晓妮
中国海南省三亚市,海南大学三亚南繁研究院,邮编572025

摘要

Pseudomonas khazarica DN-33是一种新型的氨同化聚磷酸盐积累菌(AA-PAO),具有强大的氮和磷去除能力。该菌株在48小时内能够高效去除94.31%的氨氮(NH??-N),并在聚磷酸盐培养基(PM)中保持强烈的磷酸盐吸收能力。其最佳生长条件为30°C、pH 7.0、C/N比为12:1、N/P比为1:0.6。基因组分析显示,该菌株缺乏典型的硝化基因(如amohao),但含有谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(glt)和亚硝酸盐还原酶(nirA)的基因,表明其通过异养氨同化和反硝化作用将硝酸盐还原为铵(DNRA)进行代谢。此外,还鉴定出与聚磷酸盐代谢(如ppk和ppx)及磷酸盐转运(pstSCAB)相关的基因。在高磷和氮压力下的RT-qPCR结果显示,ppkppxpstBnirA基因表达显著上调,体现了该菌株的代谢灵活性和耐盐性。这些发现不仅阐明了DN-33的氮和磷去除机制,还为其在废水生物处理中的应用潜力提供了依据。

引言

水产养殖已成为全球粮食安全的重要支柱,截至2010年已占全球动物蛋白摄入量的17%,养活了超过13亿人(FAO, 2017; Waite et al., 2014)。随着全球需求的持续增长,水产养殖现在贡献了全球渔业总产量的近一半(Bartley, 2022)。然而,这一行业的集约化也导致了富含氮和磷的废水排放,主要来源于未被食用的饲料、鱼类排泄物以及抗生素、杀虫剂和化肥等化学添加剂。更广泛地说,城市污水和农业径流也是地表水中氮和磷的主要人为来源,常常引发内陆和沿海生态系统的富营养化(Tong et al., 2020; IPCC, 2022; UNESCO UN-Water, 2023)。因此,有效的营养控制不仅需要针对水产养殖行业的具体措施,还需要整合水产养殖、城市卫生和农业的管理(Wang et al., 2024; Crowson et al., 2024)。与陆地系统不同,水产养殖废弃物在水环境中迅速扩散,使得收集和处理变得复杂(Bouwman et al., 2013),并加速了富营养化和生态退化(Kura et al., 2004)。
废水中的氮和磷去除技术通常分为物理化学方法和生物方法。虽然化学沉淀和电凝聚(EC)等手段应用广泛,但它们存在化学药品使用量大、产生大量污泥和能耗高的缺点(Nguyen et al., 2014; Tran et al., 2012; Mollah et al., 2001)。相比之下,生物营养去除(BNR)更具可持续性和成本效益,依靠微生物群落进行硝化-反硝化作用以及增强型生物磷去除(EBPR)(Fernandes et al., 2013; Wu et al., 2007)。
在传统的EBPR系统中,聚磷酸盐积累菌(PAOs)如Candidatus Accumulibacter在厌氧条件下吸收挥发性脂肪酸(VFAs),并在好氧阶段将磷酸盐以细胞内聚磷酸盐的形式积累。然而,这些系统对环境变化敏感,需要严格控制厌氧-好氧阶段的转换。系统故障可能由糖原积累菌(GAOs)的竞争性生长或自由亚硝酸等抑制性物质以及低pH值引起(Zeng et al., 2016; Stokholm-Bjerregaard et al., 2017)。
一类有前景但研究较少的一类微生物——氨同化聚磷酸盐积累菌(AA-PAOs)——能够在好氧条件下同时去除氮和磷。与反硝化PAOs或经典硝化菌不同,AA-PAOs通过异养途径直接将氨同化为生物量,同时将磷酸盐积累为聚磷酸盐(Qiu et al., 2019; Saia et al., 2021)。这种能力使得反应器配置更简单,过程稳定性更高,并在变工况下降低能耗(图1)。
尽管具有这些潜力,但AA-PAOs中营养去除的遗传和调控机制仍大部分尚未阐明。特别是在营养胁迫条件下,涉及氨同化(如glnAnirA)和磷酸盐代谢(如ppkppxpstB)的基因协调表达机制尚未得到全面研究。尽管这些基因在营养代谢中起关键作用,但其在高氮和磷负荷下的调控和相互作用仍不甚清楚。此外,很少有研究综合探讨这两种营养循环在单一菌株中的协同调控机制,限制了基于AA-PAO的生物处理系统的进展。
为填补这些空白,本研究调查了一种新分离的菌株Pseudomonas khazarica DN-33的代谢和基因调控机制,该菌株被鉴定为AA-PAO。该菌株在好氧条件下表现出强大的氮和磷去除能力。我们优化了其生长参数,进行了基因组测序和基于KEGG的代谢途径注释,并通过RT-qPCR评估了在高氮和磷条件下的关键基因表达。通过将生理表现与基因水平调控联系起来,本研究为AA-PAOs的双重营养去除机制提供了新的见解,并为其在高效、集成废水处理中的应用奠定了基础。

部分内容摘录

培养基

为了分离和功能分析Pseudomonas khazarica DN-33,我们准备了多种含有分析级试剂的培养基,并在120°C和103.4 kPa下灭菌20分钟。初始富集使用LB培养基,成分包括NaCl(10.0 g/L)、色氨酸(10.0 g/L)和酵母提取物(5.0 g/L),固体培养基中添加了2%的琼脂。用于筛选反硝化活性的溴百里酚蓝(BTB)培养基含有KNO?(1.0 g)、柠檬酸三钠(8.5 g)和MgSO?·7H?O

菌株DN-33的分离与鉴定

采用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)观察了DN-33的细胞形态。结果显示其细胞呈杆状,无鞭毛和孢子。细胞长度在1.1 μm至1.6 μm之间,宽度在0.235 μm至0.390 μm之间。固体培养基上的菌落呈湿润状,为淡黄色圆形,表面光滑,边缘均匀且无丝状物。革兰氏染色显示细胞呈红色

结论

本研究确定Pseudomonas khazarica DN-33是一种有潜力在废水处理中同时去除氮和磷的菌株。DN-33在48小时内表现出94.31%的高氨氮去除效率,同时对硝酸盐、亚硝酸盐和磷酸盐的去除效果也较为显著,尤其在处理高氨废水时表现出优势。优化实验揭示了其优选的生长条件——30°C、pH 7.0和C/N比为12——以及简单的碳源和氨氮来源

CRediT作者贡献声明

余文豪:撰写初稿、项目管理、数据管理。文能浩:资源提供、数据管理。吴晓波:数据管理。龙浩:实验研究。曾艳华:实验研究。黄爱友:方法学研究、实验研究。任伟:方法学研究、实验研究。谢振宇:监督、概念构思。蔡晓妮:撰写、审稿与编辑、监督、资金筹集。

未引用的参考文献

Huang et al., 2017
Liu et al., 2016
Liu et al., 2019
Rout et al., 2017
Xie et al., 2023
Zhao et al., 2022

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了海南省重点研发项目(ZDYF2023XDNY083)、三亚亚洲湾科技城项目(SCKJ-JYRC-2023-09)以及海南大学海洋科学技术协同创新中心项目(XTCX2022HYC23)的支持。
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