基于TF（转录因子）的羧酸生物传感器的系统优化研究——在无细胞体系中的应用

《Biosensors and Bioelectronics》：Systematic Optimization of TF-based Carboxylic Acid Biosensors in Cell-Free System

细胞游离系统代谢物传感器优化框架通过整合转录因子供应调控与启动子序列设计提升检测性能，以ita和3-羟基丙酸响应系统为例验证动态范围和灵敏度提升效果。

　　

金元熙|金成珍|郑坤英|林炫圭|郑圭烨|李正旭

浦项科技大学跨学科生物科学与生物工程系，韩国庆北道浦项市南区青岩路77号，邮编37673

摘要

快速而精确地检测小分子代谢物对于优化生物生产过程至关重要。无细胞系统（CFSs）由于其速度和适合自动化的特性，为开发此类生物传感器提供了理想的平台。然而，基于转录因子（TF）的生物传感器在体外环境中存在严重的瓶颈。由于缺乏与核仁相关的蛋白质以及与体内条件不同的DNA拓扑结构，它们的性能常常受到影响。在这里，我们提出了一个系统框架，通过整合控制TF的可用性和启动子序列来合理设计适用于CFSs的高性能TF生物传感器。以LysR型转录调节因子ItcR调控的异草酸（ITA）响应性生物传感器作为模型系统，我们证明了调节TF供应和重新设计启动子元件可以显著提高灵敏度和动态范围。启动子分析显示，在体内正常发挥作用的上游序列会干扰CFSs中的转录调控，而去除该区域后可以恢复诱导行为。随后对-35和-10基序进行微调，增强了RNA聚合酶的招募和调节因子的相互作用，使得最大信号强度提高了19倍，检测限降低了3.3倍（0.003 g/L ITA），并且剂量-响应曲线更加陡峭（Hill斜率从2.7增加到34.7）。同样的启动子工程策略也改进了3-羟基丙酸响应性生物传感器，证明了其在不同TF-启动子系统中的通用性。总体而言，这一框架为在CFSs中构建高性能、考虑拓扑结构的生物传感器提供了一种合理、模块化的方法，直接支持高通量筛选和自动化生物制造整合，适用于合成生物学和代谢工程应用。

引言

微生物细胞工厂正成为化学生产的可持续平台，为基于石油的过程提供了有前景的替代方案（Cho等人，2022年；Lee和Kim，2015年；Ye等人，2023年）。异草酸（ITA）和3-羟基丙酸（3HP）等羧酸是具有工业价值的化学品的典型例子（Feng等人，2022年；Liu等人，2023年）。然而，传统的定量方法（如液相或气相色谱）耗时、劳动密集，并不适合需要多次设计-构建-测试-学习（DBTL）循环的高通量筛选（Vilkhovoy等人，2019年）。在这些微生物细胞工厂中，对小分子代谢物的高通量监测对于加速代谢工程和简化生物制造工作流程至关重要（Li等人，2024年；Zhi等人，2023年）。基于转录因子（TF）的生物传感器提供了一种强大的替代方案，可以将特定的代谢物浓度转换为易于测量的信号（Dietrich等人，2010年；Moon等人，2024年）。在这些传感器中，配体结合改变了TF与TF响应性启动子之间的相互作用，从而调节下游基因的表达（Ding等人，2021年）。在激活型生物传感器中，配体结合诱导TF-DNA复合物的重组，改变DNA的弯曲，并稳定与RNA聚合酶（RNAP）的相互作用，从而激活转录（Augustiniene等人，2023年）。

基于TF的生物传感器可以在无细胞系统（CFSs）中操作，这些系统在开放的反应环境中进行转录和翻译（Jeung等人，2025年；Kim等人，2025年，2023年）。通过消除生存限制、生长相关资源的竞争以及克隆和转化的需要，CFSs加速了体外原型设计，并能够快速筛选大量库，允许直接使用PCR或合成得到的线性DNA（Karim和Jewett，2018年；McSweeney和Styczynski，2021年；Tinafar等人，2019年；Ullah等人，2023年）。此外，开放的反应环境允许对辅因子、底物和离子进行精确控制，从而能够在受控条件下评估酶和调节元件（Grubbe等人，2020年；Jeung等人，2025年）。这些特性，加上与液体处理自动化和人工智能（AI）辅助的实验设计及数据分析的兼容性，便于在微孔板上快速设置实验，适用于大量酶变体和条件的矩阵（Ekas等人，2024年；Jun等人，2025年；Khalil等人，2025年）。

尽管具有这种协同潜力，但仍存在一个关键瓶颈。基于TF的生物传感器的调控机制对DNA拓扑结构和与核仁相关的蛋白质（NAPs）敏感，例如组蛋白样蛋白（HU）、组蛋白样核仁结构蛋白（H-NS）、反向刺激因子（FIS）和整合宿主因子（IHF）（Norris等人，2023年）。在细胞中，染色体DNA和质粒DNA都保持超螺旋状态，其局部超螺旋密度由拓扑异构酶和NAPs决定，而体外常用的短线性模板DNA则是扭转松弛的（Ko?ar等人，2022年；Pittas和Boersma，2023年）。因此，在体内有效工作的生物传感器在体外条件下往往表现出降低或偏移的响应曲线。为了缓解这些差异，可以合理调整启动子序列，以适应松弛的拓扑结构和NAPs在较不拥挤条件下的减弱影响，从而恢复更接近体内的传感器行为（Ge等人，2011年；Ko?ar等人，2022年）。

在这项研究中，我们通过整合优化TF供应和启动子序列，开发了一个系统框架来提高CFSs中基于TF的生物传感器的性能。首先，我们优化了ITA响应性LysR型转录调节因子ItcR的表达和可用性，以增强转录激活并减少CFSs中的资源竞争。随后，我们确定了对ITA响应性至关重要的启动子区域，并观察到在体内正常发挥作用的上游序列会由于DNA拓扑结构和NAPs的不同而在CFSs中干扰转录调控。此外，我们对-35和-10基序进行了序列级工程，以微调RNAP的招募和调节因子的相互作用，从而显著提高了生物传感器的动态范围和灵敏度。最后，我们通过将相同的策略应用于另一种对3HP响应的LysR型启动子，证明了这一设计原则的普遍性，确认了该启动子工程框架在体外生物传感器优化中的广泛应用。

部分摘录

质粒构建和DNA制备

所有质粒都是使用New England Biolabs（美国马萨诸塞州Ipswich）的NEBuilder^R HiFi DNA Assembly构建的，并在Thermo Scientific（美国马萨诸塞州Waltham）的克隆宿主E. coli Mach1-T1^R中扩增。用于质粒构建和模板DNA制备的所有寡核苷酸均由Cosmo Genetech（韩国首尔）合成（表S1）。质粒DNA和PCR产物使用Exprep? Plasmid SV试剂盒和Expin? PCR SV试剂盒提取和纯化

优化转录因子表达以增强动态范围

基于在CFSs中优化基于TF的生物传感器的系统方法，该方法整合了对TF可用性的合理控制和启动子工程。首先选择TF表达作为提高生物传感器灵敏度、动态范围和信噪比的关键因素。许多研究主要集中在通过调整CFSs中的TF DNA浓度来调节TF活性（Beabout等人，2021年；Ekas等人，2024年；Liu等人，2020年；Pandi等人，2019b年；Voyvodic等人，

结论

本研究表明，通过协调调整TF的可用性和启动子结构，可以系统地优化基于TF的羧酸生物传感器，以适应CFSs。分析表明，在体内起作用的启动子序列在体外可能会因为DNA拓扑结构的差异和NAPs的缺失而失去调控精度，这突显了考虑拓扑结构的启动子设计的重要性。通过去除对拓扑结构敏感的上游区域并合理优化核心部分

CRediT作者贡献声明

李正旭：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念化。郑圭烨：撰写 – 审稿与编辑，监督。金成珍：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，形式分析。郑坤英：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据管理，概念化。金元熙：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，调查，形式分析，数据管理，概念化。林炫圭：

未引用参考文献

Jun等人，2025年；Lim等人，2018年；Pisani和Carbonell，2025年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）的生物与医疗技术发展计划（项目编号RS-2024-00439931和RS-2025-16070008）的支持。本研究还得到了韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）的资助（项目编号RS-2024-00398252）。本研究还得到了韩国科学技术信息通信部（MSIT）资助的韩美合作研究基金（KUCRF）的资助。