通过多平台非靶向代谢组学技术，在哥伦比亚特色咖啡的固态发酵过程中发现了新的代谢物

《Food Chemistry》：Discovery of novel metabolites in Colombian specialty coffee via multiplatform untargeted metabolomics during solid-state fermentation

咖啡豆固态发酵过程中黏膜与胚乳代谢物动态研究。通过GC-QTOF-MS和LC-QTOF-MS技术分析3批次咖啡，发现黏膜和胚乳代谢指纹存在显著差异，黏膜中11种代谢物随时间变化，胚乳中2种代谢物变化明显。共鉴定269种代谢物，其中193种为咖啡发酵新发现，揭示了固态发酵中微生物代谢与胚乳自体代谢的协同作用及新活性代谢物。

　　

Dolly Margot Revelo-Romo | Johannes Sikorski | Selma Vieira | Nelson Humberto Hurtado-Gutiérrez | J?rg Overmann | María Francisca Villegas-Torres | Andrés Fernando González-Barrios

生物电化学研究小组（BEQ），生物系，精确科学与自然科学学院，农业科学博士项目，纳里尼奥大学，Calle 18, Cra. 50 Campus Torobajo, Pasto 520002，哥伦比亚

摘要

阿拉比卡咖啡在固态发酵过程中的代谢物组成尚未得到充分研究。本研究利用气相色谱-四极杆飞行时间质谱（GC-QTOF-MS）和液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）技术，分析了哥伦比亚一个小农户农场中果胶和胚乳代谢物的变化。在三个批次中，两种基质中检测到了600多种化合物。样品分别在0小时、5小时和10小时采集，其中一个批次进行了深度采样分析。在63种通过GC-QTOF-MS库鉴定的化合物中，有42种能够区分胚乳和果胶；而在11种和2种化合物中分别能够区分不同发酵时间对果胶和胚乳的影响。在557种通过LC-QTOF-MS(+)鉴定的化合物中，有206种具有区分能力，并被标注了不同的置信度。尽管在发酵结束时胚乳中的代谢物数量最多，但果胶中发现的具有区分能力的代谢物更多。总共鉴定出269种化合物，其中包括193种首次在咖啡发酵过程中被报道的代谢物。这些发现揭示了独特的代谢物特征以及一些可能具有重要性的新代谢物。

引言

哥伦比亚阿拉比卡咖啡的独特风味源于多种因素的复杂相互作用，包括其独特的地理起源、气候以及影响咖啡种植和产后加工的文化习俗。因此，哥伦比亚不同地区的咖啡质量各具特色。纳里尼奥咖啡就是一个值得注意的例子，自2011年起获得了原产地名称保护（SIC, 2011），并被公认为具有独特风味和香气的高品质美食产品，这有助于其在国际市场的定位。 咖啡发酵是产后加工的关键步骤，因为它可以去除果胶，并显著影响消费者对咖啡风味和香气的感知。咖啡果实的发酵或去果肉处理可以通过多种方法进行，包括开放环境发酵、二氧化碳浸渍厌氧发酵、自诱导厌氧发酵（SIAF）、浸水或水下发酵（添加水）、固态发酵（不添加水），以及自发发酵或使用发酵剂引导的发酵过程（Ferreira等人，2023年）。咖啡种植者根据经验知识、市场因素（Pe?uela-Martínez等人，2023年）以及农场加工系统的操作能力来决定发酵方法和时间（Góngora等人，2024年）。因此，发酵时间差异很大，从10小时到480小时不等（Góngora等人，2024年；Revelo-Romo等人，2025年）。哥伦比亚咖啡生产商常用的传统方法是两阶段发酵工艺（Córdoba等人，2024年），包括24-72小时的咖啡果实预发酵期，随后是对去果肉后的咖啡豆进行发酵。在哥伦比亚，自发固态发酵仍然是主要采用的方法（Pe?uela-Martínez等人，2023年）。 在咖啡自发发酵过程中，微生物会分解果胶并产生代谢物，这些代谢物可能会扩散到胚乳中，改变其化学组成并影响咖啡质量（Ferreira等人，2023年）。同时，胚乳仍保持代谢活性，因为去果肉过程会引发发芽，并使其暴露于缺氧和渗透压等非生物胁迫下（Osorio等人，2023年；Zhang, De Bruyn, Pothakos, Torres等人，2019年）。因此，了解咖啡发酵过程需要同时研究果胶中的微生物活动和胚乳中的内源性代谢反应。然而，发酵过程中这两种基质中产生的代谢物多样性仍然不够充分。 代谢组学分析基于小分子代谢物的检测来阐明生物过程。靶向代谢组学使用化学标准定量预定义的代谢物，而非靶向代谢组学则通过定性分析发现以前未表征的代谢物（Selamat等人，2021年）。代谢物鉴定通常依赖于色谱方法（如液相色谱（LC）和气相色谱（GC）以及质谱（MS）和核磁共振（NMR）等检测技术。当与四极杆飞行时间（QTOF）质谱仪和电喷雾离子化（ESI）或电子离子化（EI）等离子化技术结合使用时，这些平台能够在广泛的代谢物范围内提供更高的灵敏度和质量准确性（Selamat等人，2021年）。 大多数关于咖啡发酵的代谢组学研究采用靶向方法，监测去果肉后咖啡发酵或整颗咖啡果实发酵过程中果胶和胚乳中的代谢物变化（de Bruyn等人，2017年；Elhalis, Cox, & Zhao，2020年；Elhalis, Cox, Frank等人，2020年；Zhang, De Bruyn, Pothakos, Contreras等人，2019年；Zhang, De Bruyn, Pothakos, Torres等人，2019年）。这些研究共鉴定出73种目标化合物，包括糖类、有机酸、乙醇、多元醇、短链脂肪酸（SCFA）、咖啡豆特异性化合物（咖啡因、三角芥子碱、六种绿原酸[CGA]异构体、阿魏酸和咖啡酸）、游离氨基酸以及低分子量挥发性物质。这些研究还阐明了这些代谢物在微生物和植物代谢中的作用及其对咖啡品质的贡献。应用于固态咖啡发酵的靶向代谢组学进一步揭示了哥伦比亚咖啡中糖类和有机酸的变化，并证明了乙酸向咖啡豆中的扩散（Osorio等人，2023年）。 相比之下，非靶向代谢组学在研究果胶和胚乳发酵中的应用较少。在厄瓜多尔的水下咖啡发酵过程中，发酵水中检测到了100多种挥发性有机化合物（VOCs），胚乳中检测到了170多种VOCs，这些化合物的含量随发酵时间的变化而变化，为咖啡增添了果香特征并提升了整体风味强度（Zhang, De Bruyn, Pothakos, Torres等人，2019年）。许多VOCs对应于关键的风味描述符，如甜味、花香、果香、巧克力味、栗子味、香料味等（de Melo Pereira等人，2019年），它们是重要的风味标志物（Revelo-Romo等人，2025年）。然而，区分这些VOCs是来自微生物代谢还是胚乳活动仍然具有挑战性（Zhang, De Bruyn, Pothakos, Torres等人，2019年）。最近的一项非靶向代谢组学研究在中国的水下发酵过程中鉴定出胚乳中的2548种代谢物，其中包括82种差异修饰的代谢物（Shen等人，2023年）。 非靶向代谢组学提供了一种强有力的方法，用于识别可能影响咖啡品质的非传统化合物，特别是在固态发酵等较少研究的发酵策略中。我们假设在这种过程中缺乏液体流动可能会产生与水下发酵不同的代谢物变化。本研究的目的是利用气相色谱-四极杆飞行时间质谱（GC-QTOF-MS）和液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）技术，确定Coffea arabica var. Colombia在固态发酵过程中的果胶和胚乳代谢物变化。这是首次将这些技术应用于发酵过程中的这两种基质。研究取得了两个主要成果：使用微生物组衍生化合物数据库鉴定出微生物代谢物；以及检测出具有潜在生物活性或适合作为哥伦比亚咖啡生物标志物的化合物。

咖啡品种与咖啡发酵

2022年7月至8月期间，从哥伦比亚纳里尼奥省Buesaco镇Veracruz村的Loma Gorda咖啡农场采集了Coffea arabica L. var. Colombia（红色果实）的咖啡果实。实验地点位于北纬01°21′48.8″，西经077°09′30.9″，海拔2120米。选择这个农场是因为其在特种咖啡生产方面的专业知识。咖啡的产后加工遵循传统方法，只使用健康成熟的咖啡果实进行加工

咖啡发酵过程中的pH值和温度动态

去果肉后咖啡的初始pH值在T1和T3批次中为4.7，在T2批次中为4.3。随着发酵的进行，所有罐中的pH值均下降，最终降至4.0（补充图S1A）。发酵过程中，中间区域的温度最高，其次是上层和底层区域（补充图S1B）。底层和上层的温度在整个发酵过程中相对稳定，仅在最后几个小时略有上升。

讨论

去果肉前的咖啡果实批次中绿色果实的比例较低（<2.5%），表明该批次的质量在可接受范围内（Guerrero等人，2022年）。在固态发酵开始时，不同罐之间的pH值差异可能归因于果实本身的差异以及预发酵阶段发生的微生物活动差异。在这个阶段，碳水化合物被释放出来

结论

使用预发酵过的咖啡果实进行的10小时固态发酵过程并未妨碍区分胚乳和果胶之间的差异，也未妨碍不同发酵时间点之间的差异。观察到的独特代谢物特征表明，这两种基质为咖啡豆的最终组成提供了不同的但可能是相互关联或相互依赖的代谢贡献。值得注意的是，这项研究首次报道了

CRediT作者贡献声明

Dolly Margot Revelo-Romo：写作 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学设计，概念构建。 Johannes Sikorski：写作 – 审稿与编辑，形式分析。 Selma Vieira：写作 – 审稿与编辑。 Nelson Humberto Hurtado-Gutiérrez：写作 – 审稿与编辑。 J?rg Overmann：写作 – 审稿与编辑，方法学设计。 María Francisca Villegas-Torres：写作 – 审稿与编辑。 Andrés Fernando González-Barrios：写作 – 审稿与编辑，概念构建。

资金来源

本工作得到了纳里尼奥大学研究与社会互动办公室（VIIS）的支持，项目代码为2218；以及哥伦比亚科学技术创新部（MinCiencias）的“高级人才培养项目 – 纳里尼奥国立大学”（BPIN 2019000100023）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者还要感谢met.core使用GC-QTOF-MS和LC-QTOF-MS(+)技术进行非靶向代谢组学分析，并协助获取用于MS/MS分析的数据。作者还要感谢来自Buesaco市Cuchilla Loma Gorda农场的咖啡生产商Guillermo Valencia Burbano，他允许研究团队在其农场研究咖啡的产后加工过程