《ACS Materials Au》：3D-Printed Biohybrid PE/PCL Biphasic Osteochondral Plug for Knee Cartilage Repair
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本文报道了一种利用3D打印技术制备的生物杂化聚乙烯（PE）/聚己内酯（PCL）双相骨软骨栓（OCP），用于修复膝关节软骨缺损。研究通过开环易位聚合（ROMP）合成含有精氨酰甘氨酰天冬氨酸（RGD）肽的刷状共聚物，并优化其与超高分子量聚乙烯（UHMWPE）的复合配方（10 wt% PE-RGD），该配方在体外能显著促进人软骨细胞（CHON-001）增殖（1.4倍）。采用双喷嘴熔融长丝制造（FDM）技术成功打印具有互锁结构的两相植入物，猪膝关节缺损模型体内实验表明，植入物可诱导透明软骨再生（88.5%），优于微骨折技术（79.3%），但骨相孔隙度需进一步优化以促进骨整合。
引言
膝关节关节软骨缺损是一种常见且具有挑战性的临床问题，高达60%的膝关节镜手术患者受累。由于软骨无血管、无神经的特性，其自愈能力极差。未经治疗或修复不当的缺损常导致关节退变、疼痛、功能障碍，并进展为骨关节炎（OA）。OA是全球致残的主要原因，影响超过5亿人，占全球人口的7%，导致巨大的医疗支出。目前的治疗方法如微骨折、自体软骨细胞植入（ACI）和骨软骨移植效果不一、恢复期长，且常形成力学性能较差的纤维软骨而非耐用的透明软骨。尽管近期有FDA批准的碳酸钙双相骨软骨栓，但其潜在不良反应较多，且仅限用于运动损伤所致的软骨缺损。因此，开发安全有效、能理想地再生透明软骨以延长膝关节寿命、延迟或避免关节置换术的早期至中期骨关节炎治疗方案至关重要。
聚乙烯是关节植入物（如膝关节假体中的胫骨托盘和髋关节假体中的髋臼杯衬垫）关节面的常用材料。超高分子量聚乙烯（UHMWPE）或交联聚乙烯（XPE）用于这些植入物。因此，研究选择UHMWPE作为植入物的软骨组分。然而，UHMWPE高度惰性，据报道可能通过异物反应引起周围组织炎症。因此，需要改善UHMWPE的生物学特性，使其具有软骨再生和抗炎特性。利用能与体内特定细胞结合的生物分子进行组织再生是一个新兴且日益流行的领域。通过使用能与生长因子或整合素结合的寡肽和寡糖等生物分子来促进组织生长，可以避免细胞植入，这不仅简化了手术操作，也避免了细胞植入相关的风险，如肿瘤形成或神经损伤。
研究团队先前已证明其生物杂化聚乙烯在体内皮肤组织再生中有效。他们设想将软骨生成生物分子纳入聚乙烯刷状共聚物中，可使UHMWPE具备软骨生成特性。此外，使用具有免疫调节作用的生物分子可能使植入物具备一定的抗炎特性。另外，团队也报道了生物杂化聚己内酯（PCL）的骨诱导特性。基于PE/PCL双材料植入物，他们提出了一种双相骨软骨栓，有望在体内同时再生软骨和骨，用于膝关节缺损修复。采用熔融长丝制造（FFF）3D打印技术制造植入物，以创建高度多孔的结构，允许血液从骨流向植入物表面以促进软骨再生。同时，报道了一种独特的互锁设计，以防止由两种极性差异巨大的聚合物构成的双相植入物发生分层。膝关节承受关节运动产生的高剪切力，因此确保双相植入物的坚固性至关重要。
结果与讨论
聚合物合成与表征
为创建能够软骨再生的配方，研究检验了多种据报道具有软骨生成能力的生物分子。精氨酰甘氨酰天冬氨酸（RGD）三肽和透明质酸（HA）均被报道支持软骨生成。层粘连蛋白衍生肽A5G81因其支持细胞粘附、迁移和增殖的能力，也是软骨再生的潜在候选者。除了软骨生成特性，研究也对生物分子的免疫调节效应感兴趣。RGD三肽被报道可与αVβ6和αVβ8整合素结合进行免疫调节。因此，研究特别关注用RGD制备的生物杂化PE。尽管如此，团队仍通过合成生物杂化聚合物，并将这些刷状聚合物分别与UHMWPE复合，测试了PE-RGD、PE-A5G81和PE-HA与软骨细胞的生物相容性。
降冰片烯（NB）封端的PE和PCL大分子单体（NB-PE, NB-PCL）以及基于降冰片烯-聚乙二醇（PEG）的RGD、HA和A5G81大分子单体（NB-PEG-RGD, NB-PEG-HA, NB-PEG-A5G81）均根据先前报道的方法制备。简言之，将琥珀酸封端的PE与己二胺（HMDA）作为连接体连接，然后进行降冰片烯功能化，形成NB-PE大分子单体用于后续共聚。类似地，NB-PCL大分子单体通过由降冰片烯封端的丙醇引发的ε-己内酯开环聚合（ROP）获得。NB-PEG-生物分子大分子单体通过HBTU介导的NB-PEG与RGD、HA、A5G81的偶联反应形成。获得这两种大分子单体后，在Grubbs第三代催化剂[G3]存在下，于THF中通过开环易位聚合（ROMP）合成PCL-RGD。该共聚反应转化率优异（>95%），NB-PEG-RGD掺入量为8%。PE基刷状共聚物在Grubbs第二代催化剂[G2]存在下，于甲苯中高温（100 °C）合成。该共聚反应的平均转化率为77%，NB-PEG基大分子单体的掺入量为3-4%。
材料的体外研究
将生物杂化聚合物与三井化学的UHMWPE L5000复合，制成独立的配方。这些配方随后被3D打印成1 × 1 cm2的薄片用于软骨细胞活力测试。然而，发现薄片会持续漂浮在培养基表面，失去与附着在组织培养板底部的软骨细胞的接触，导致测试不准确。因此，开发了一种新的部件设计，使样品能完全浸没在测试培养基中，在整个培养期间与软骨细胞保持持续接触。经过反复试验，创建了一种使用UHMWPE配方打印的独特U形测试样品。
使用人软骨细胞（CHON-001 ATCC）测试生物杂化PE的生物相容性以及这些材料诱导软骨细胞增殖的能力。进行了软骨细胞增殖动力学测定以确定评估软骨细胞生长的最佳时间点。观察到软骨细胞数量增加，但由于24孔培养板测试系统的空间限制，在96小时时缓慢接近平台期。因此，软骨细胞与生物杂化PE样品的孵育仅进行48小时，以确定这些材料促进软骨细胞增殖的能力。测试了PE-RGD、PE-A5G81和PE-HA样品的软骨细胞测定，最初发现PE-RGD和PE-HA是有前景的材料，显示出统计学上显著诱导细胞增殖的增加。为了进一步确认，进行了更多测试，发现PE-RGD样品持续导致人软骨细胞增殖的统计学显著增加，而PE-HA则未达到此效果。接下来，对PE-RGD样品进行了剂量依赖性软骨细胞测定，以确定最大软骨细胞增殖所需的最佳配方。研究表明，10 wt% PE-RGD在UHMWPE中导致最高的软骨细胞增加（1.4倍）。5 wt%和20 wt%的PE-RGD导致较低的软骨细胞增加。因此，确定10 wt% PE-RGD在UHMWPE中为植入物制造所需的最佳配方。
另外，还使用软骨细胞测定测试了PCL-RGD和PCL-HA/PCL配方，以评估生物杂化PCL在增强软骨细胞增殖方面的能力。该研究旨在探讨是否有可能在植入物制造中仅使用单一聚合物PCL，这将简化下游植入物设计和制造方法。不幸的是，PCL-RGD和PCL-HA在孵育48小时后均未能诱导软骨细胞数量的显著增加。先前已报道了PCL-生物分子刷状共聚物与成骨细胞的生物相容性测试以及体内炎症测试。同样，PE-生物分子刷状共聚物与成骨细胞和皮肤成纤维细胞的生物相容性研究以及体内炎症反应也已报道。
骨软骨栓的制造
双相骨软骨栓（OCP）的设计旨在平衡骨和软骨相的修复。双材料植入物可以更好地优化每个组分的材料特性，包括力学性能、各组分的生物降解性，以及重要的是，栓每个相中靶向再生的组织。研究团队先前已报道了PCL-RGD的骨诱导能力。栓的骨相将由10 wt% PCL-RGD在PCL基础聚合物中制成。另一方面，软骨相将由10 wt% PE-RGD在UHMWPE中制成。关于使用3D打印技术的双相OC支架的报道很少。Kilian等人报道了一种双相生物打印的含人软骨细胞的陶瓷-藻酸盐支架。骨相由无细胞磷酸钙骨水泥制成，软骨相由封装hCh细胞的藻酸盐水凝胶制成。3D打印支架局限于0, 90°木堆设计，这可能限制了与材料结合时的打印挑战。尽管在这些生物打印支架中观察到了软骨形成，但未报道体内的软骨形成。
研究的双相PE/PCL OCP通过熔融沉积建模（FDM）方法使用Ultimaker S5双喷嘴打印机进行3D打印制造。虽然聚己内酯（PCL）的3D打印日益普及且易于复制，但超高分子量聚乙烯（UHMWPE）的情况则不同。传统上，由于UHMWPE具有挑战性的热行为、低表面能和高疏水性，其制造仅限于注塑成型等传统技术。这些材料特性对其在熔融沉积建模（FDM）中的应用构成了显著障碍，迄今为止通过FDM进行UHMWPE 3D打印的实例很少见。据报道，近零熔体流动速率和高熔体粘度阻碍挤出过程达到无法实现工艺稳定性的程度，这严重影响了制丝过程。聚烯烃（如PP/PE）的高结晶度据报道对FDM型3D打印构成重大挑战。高收缩、翘曲和附着力差是打印聚烯烃时的常见结果，使得获得良好的打印质量极其困难。这与研究团队在UHMWPE的FDM工艺优化过程中的初步发现一致。
为了减轻使用生物活性UHMWPE打印OC栓头过程中的这些挑战，研究优化了多个打印参数，包括关键参数如打印温度、构建板温度和冷却速度。只要正在沉积生物活性PE，打印温度和构建板温度就保持在优化值，并且编程为在打印核心切换用于打印生物活性PCL的OC栓杆时缓慢降低。冷却速度编程为在沉积几层生物活性PCL后开始，以确保先前的生物活性PE层已充分冷却，防止任何翘曲和/或分层。其他参数，如打印速度、外壁擦拭距离和水平扩展，旨在提高部件的打印保真度，并降低因从构建板上过早分层而导致的打印失败风险。本质上，打印过程考虑了UHMWPE和PCL在其加工参数下的各自材料行为和处理参数。工艺优化的挑战在于使用非常规制造方法，在单一制造过程中整合两种截然不同材料的加工参数。
除了挤出和3D打印工艺的参数优化外，还结合了部件设计，通过约束栓头和栓杆之间的平移和旋转运动，进一步增强制造可行性和OC栓的使用寿命。OC栓头包含带凹口的锥形公头变体，而相应的母头变体可在OC栓杆上找到。这种设计确保了两个子部件在植入后不会彼此分离。
值得注意的是，研究团队是首批开发和优化使用FDM制造无细胞UHMWPE基骨软骨栓所需打印参数的团队之一，在本文发表时代表了该领域的重大进展。此外，研究的OC栓由两种不同材料制成的两个组件组成，这进一步增加了制造过程的难度。然而，通过严格优化FDM制造过程，平衡打印速度、热管理和部件设计，已成功实现。
猪膝关节缺损模型的体内研究
在猪膝关节软骨缺损模型中进行了为期24周的体内研究，以临床标准实践“微骨折”作为对照。对于植入部位，通过在膝关节的外侧或内侧间室钻孔创建直径1厘米、深1厘米的缺损。然后将OCP手动插入缺损处，并轻轻敲击以确保栓与缺损处紧密贴合。对于对照组，使用穿刺活检工具包在软骨表面创建直径1厘米的缺损，并在骨中钻3个直径1毫米的孔以模拟微骨折程序。在6头猪的12条后肢上共创建了24个缺损。样本和对照组随机分布在所有24个缺损中，位于内侧或外侧间室。猪存活24周后处死。处死后立即采集肢体，置于冰上，并立即送去做MRI扫描。MRI扫描完成后，立即采集组织进行组织学分析。
从肢体提取的膝关节样本的初步评估可以看出，栓表面有软骨生成，新形成的软骨与周围软骨融合，表明形成了透明软骨。在这种情况下，测得缺损闭合率为68%。另一方面，微骨折模拟样本显示软骨生长很少。相应的脱钙组织样本的H&E染色组织学图像也证明了这一点。
使用番红O-固绿染色来区分再生的软骨类型并识别矿化骨组织。从染色图像可以观察到，植入OCP的缺损被大量透明软骨覆盖，并与周围软骨整合，而微骨折样本的软骨生长不均匀，透明软骨形成碎片化。基于对所有采集和染色的组织样本的定量分析，OCP样本组组织平均有88.5%的透明软骨形成，而微骨折样本组仅有79.3%的透明软骨形成。因此，独立病理学家确定骨软骨栓更有利于透明软骨的产生。然而，在此研究过程中，观察到软骨生长高度依赖于植入技术。在两个OCP组织样本中，观察到栓未完全插入缺损处，部分栓突出于关节表面。这导致软骨再生不良，仅形成5.9%的新软骨。缓解此问题的一个潜在方法是设计一套植入物专用器械，首先允许精确深度、直径的膝关节取芯以去除病变组织；其次，使用插入器械将栓插入关节处创建的孔中，并带有指示器告知骨科医生栓已插入正确深度。借助这套器械，该手术有可能以微创方式进行。
除了软骨再生，番红O-固绿染色也使观察骨再生成为可能。从所有植入OCP的组织样本中，观察到植入物内部骨生长极少。然而，在PCL组分已生物降解的区域观察到了骨生长。这可能是由于植入物设计中骨组织再生的孔隙度不足。即使OCP上有85%的软骨再生，栓内部的新骨形成也极少，大多数新骨形成在栓周围（30%新骨形成）。需要进一步改进OCP设计，特别是PCL组分的孔隙度，以实现植入物内最佳的骨生长。
结论
总之，研究报道了生物杂化聚合物增强软骨细胞增殖的能力及其在软骨再生中的应用。采用双喷嘴熔融长丝制造3D打印技术制备了由生物杂化聚乙烯和生物杂化PCL制成的骨软骨栓（OCP），创建了一种用于关节修复的双相栓。设计中加入了互锁特征以防止两个不同聚合物层分层。将OCP植入患有膝关节缺损的猪体内6个月，采集组织进行分析。在植入OCP的样本中观察到透明软骨形成，特别是当OCP位于周围软骨表面以下时，并且在PCL组分已降解的OCP部分观察到了新骨形成。因此，研究确信UHMWPE中的PE-RGD能够诱导透明软骨形成，而PCL中的PCL-RGD能够诱导骨整合。然而，植入物设计需要优化以促进植入物内部的骨生长，从而促进PCL组分更好的骨整合。可以开发植入物专用器械，以实现更精确的栓插入，提高软骨再生率。关于PE-RGD诱导透明软骨再生能力、植入物设计优化的进一步研究正在进行中。
实验部分
刷状共聚物PE5,000–RGD, PE5,000–A5G81, PE5,000–HA和PCL-RGD根据报道程序，在Grubbs第二代或第三代催化剂存在下，通过开环易位聚合（ROMP）形成。琥珀酸酐封端的聚乙烯（SA-t PE）（分子量5,000）和UHMWPE L5000由三井化学株式会社通过研究合作协议提供。Resomer C212（PCL）购自赢创工业股份公司。肽序列RGD和A5G81购自金斯瑞公司。透明质酸（HA）（分子量3,000–5,000）购自Glentham Life Sciences Ltd。所有试剂均按原样使用，无需进一步纯化。
将Resomer C212（PCL）（最初以颗粒形式提供）通过液氮低温研磨转化为粉末以便于加工。将UHMWPE与PE-RGD以9:1的比例混合，制成“生物活性PE”粉末混合物。类似地，将PCL与PCL-RGD以相同的9:1比例结合，制成“生物活性PCL”粉末混合物。所有混合均使用SPEX 8000D混合/研磨机进行，至少2分钟。
使用ThermoScientific Process 11双螺杆挤出机将生物活性粉末混合物挤出成直径为2.85 ± 0.1 mm的丝材。每种生物活性材料的挤出参数见支持信息文档。
使用Ultimaker S5双喷嘴打印机，利用生物活性PE和PCL丝材进行部件制造。在打印参数化和创建3D打印机所需的gcode文件时也使用了Ultimaker Cura切片软件。一般打印参数在支持信息文档中提供。
人软骨细胞（CHON-001）购自ATCC，按照ATCC建议，在完全培养基中维持培养，并于37°C、95%空气和5% CO2条件下孵育。简言之，将50,000个人软骨细胞接种到24孔组织培养板中，培养板中含有或不含灭菌的U形3D打印生物材料，并在上述条件下的完全培养基中培养。48或96小时后，使用每孔1 mL的0.05%胰蛋白酶-0.53 mM EDTA溶液收获细胞，并于37°C、5% CO2下孵育5分钟。轻轻涡旋细胞，并在倒置显微镜下观察直至细胞层分散。将脱落的细胞重悬于完全软骨细胞培养基中，并于125g离心5分钟。细胞沉淀用冰预冷PBS洗涤两次，然后于-80°C冷冻以备进一步分析。根据制造商说明进行细胞增殖测定，使用已知CHON-001细胞数制作标准曲线。使用酶标仪
