《Analytical Chemistry》：Electrochemical Detection of Organophosphates Using Dual-Modal Enzyme-Based Biosensors
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本文报道了一种利用磷酸三酯酶（PTE）和乙酰胆碱酯酶（AChE）构建的双模式电化学生物传感器，通过开尔文电位法（OCP）和安培法（i-t）实现“开启/关闭”（turn-on/turn-off）信号互补验证，有效克服了传统AChE传感器假阳性高的缺点。该传感器采用深共晶溶剂（DES）薄膜（~20 μL）维持酶活性，实现了对模型有机磷化合物甲基膦酸二甲酯（DMMP）蒸气的高选择性、实时检测（PTE与AChE传感器的检测限分别为17.6±8.7 ppm和2.5±0.6 ppm），为农业环境中有机磷农药漂移和污染的现场监测提供了便携、可靠的解决方案。
引言
有机磷化合物的应用对于维护粮食安全和食品安全至关重要，但其非靶标暴露带来的风险也不容忽视。杀虫剂的飘移和径流会影响到施药者、水生生态系统和其他非靶标生物。这些风险促使人们必须开发用于农用化学品修复和监测的技术，以保护环境和公众免受有机磷化合物的危害。此外，一个能够连续监测的系统可以阐明有机磷化合物的飘移和污染情况。有机磷化合物以其急性毒性而闻名，它们靶向乙酰胆碱酯酶（AChE），阻碍神经传递，从而破坏神经系统。有机磷化合物会造成不同程度的伤害甚至死亡，据估计，仅有机磷农药每年就导致20万人死亡。这些案例表明，迫切需要功能性传感器来监测像AChE这样的蛋白质的活性，以及该活性如何被有机磷化合物抑制。
研究人员已经开发了检测有机磷化合物的方法，包括质量敏感型、化学电阻型和场效应晶体管传感器。然而，由于上述方法可能受到选择性、灵敏度或制备工艺不一致等问题的困扰，因此需要更快速、更简便的检测方法。同样，比色和荧光检测器已被开发用于快速检测多种有机磷化合物，但通常在稳定性和便携性方面面临挑战，而这些特性对于连续监测是必需的。此外，传统的AChE活性比色检测方法——Ellman法，因其灵敏度和易产生假阳性的倾向而受到审视。因此，探索更可靠、更稳健的有机磷化合物检测和定量方法至关重要。
或许更有前景的是，电化学技术因其响应时间快、检测模式特异和便携性而得以应用。与微型化恒电位仪耦合的传感器可以为有机磷化合物揭示一种新的传感范式。除了监测AChE活性外，其他酶学方法可以补充有机磷化合物的检测。磷酸三酯酶（PTE）作为一种额外的识别元件已被研究用于检测有机磷化合物，因为它能够通过水解作用解毒此类物质。几种电化学传感器已经成功地监测了田间土壤、河水和人血清中的有机磷化合物对氧磷、对硫磷和甲基膦酸二甲酯（DMMP）。最近，Job等人（2023年）合成了一种突变PTE链，能够水解更广泛的化合物，同时展示了更高的催化效率，这使得该突变PTE成为一种有吸引力的生物识别剂，可以电化学检测并清除更多种类的有机磷化合物。通过将AChE和PTE传感器耦合用于有机磷化合物检测，可以开发出一种双模式设备。双模式传感模型通过比较多个输出信号来提高模型准确性，其考虑的是内部参考信号或双“开启/关闭”信号。因此，通过创建基于两个信号而非单个信号绝对值的双模式模型，限制了经典电化学传感中出现的典型变异来源（例如，电极形态、生物识别剂负载量），并通过交叉验证为信号提供了进一步的可信度。通过将双传感技术与紧凑便携的恒电位仪进一步集成，可以实现一种低功耗、低成本的解决方案，类似于其他监测海水中重金属盐和现场爆炸物残留的工作。所提出的设备满足了美国联邦航空管理局（FAA）指定的无人航空系统（UAS）所需的尺寸、重量和功率（SWaP）标准。将紧凑的微电子设备集成到UAS中，可以实现同时进行农用化学品监测和决策（例如，精准农业、农用化学品绘图）。
在此，通过设计一个与紧凑型恒电位仪配对的双模式电化学系统，我们提出了一种可靠且稳健的技术，用于实时监测有机磷蒸气。结合两个电化学系统，提出了一个独特的建模挑战。这通过一个分段模型来解决，该模型增加了一定程度的自校正、相互验证和信号标准化。选择DMMP作为模型有机磷化合物，是因为其与其他有机磷农药的结构相似性，以及其较低的毒性，从而在测试和处理过程中提供了更安全的工作环境。此外，DMMP作为不含硝基芳香族基团的有机磷农药的优异类似物，而硝基芳香族结构是电化学和光学检测含硝基芳香族农药常用的探测结构。该双模式系统展示了宽广的线性范围，AChE和PTE功能化生物传感器的线性范围分别为1至100 ppm和50至1000 ppm。该电化学系统能够识别DMMP蒸气，并在较长时间内保持稳定的读数。我们报道的工作提出了一种微型化、低功耗的技术，可以部署在多种传感环境中。
结果与讨论
制备与操作方法
设备的制备和操作方法阐明了双模式系统的工作机制。图1展示了生物传感器及其集成组件的制备方案、功能化步骤和反应机理。制备方案（图1a）从功能化磁珠开始，磁珠被用作生物功能化支架，为生物传感创建了一个致密的酶网络。与传统的功能化载体（例如，碳纳米管、金属纳米颗粒、电极表面）相比，磁珠具有高比表面积和易于通过磁铁操作的优点，允许进行多次洗涤和组装步骤，并且具有多种官能团。本研究中使用的磁珠是氨基封端的，这允许胺反应性交联剂与磁珠结合。选择双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS3）作为胺反应性交联剂，它与磁珠上的功能性氨基和酶上的氨基附着点结合。BS3已用于量子点（QD）组装，通过将肽功能化的QD连接到二氨基酯上进行F?rster共振能量转移（FRET）生物传感。这种交联剂允许精细控制酶与磁珠的多点共价连接，由于限制了构象变化和变性，从而赋予了酶稳定性。尽管可以通过吸附将游离酶直接功能化到电极表面，但此类方法的特点是酶结合弱、稳定性差，最终会导致酶脱落；因此，固定化技术对于提高传感器稳定性和长期监测是必要的。将酶混合物滴铸到电极上以实现设备的生物功能化。接下来，小心地将一层2-ply Kimwipe纸巾放置在酶层上方，作为溶剂系统的吸附剂。通过施加带有粘性周边的尼龙网将Kimwipe固定到位。最后，将深共晶溶剂（DES）滴铸到网上，DES会渗透整个Kimwipe，形成一个体积小（~20 μL）的电化学池。所开发的紧凑型微电子器件与标准电化学技术相结合，提供了一种强大、实时的污染物监测分析工具，符合当前对易于制备、价格低廉、微型化的污染物传感器的需求。
酶作为生物识别剂，可以在各种环境和代谢过程中选择性识别目标分子。磷酸三酯酶（PTE）和乙酰胆碱酯酶（AChE）可与一系列有机磷化合物相互作用，基于这些相互作用，可以转导与反应产物相关的电信号。PTE通常水解有机磷化合物，导致pH变化，这可以在pH敏感电极上通过电位法读取。在这项工作中，使用了RuO2丝网印刷电极（SPE），因为其作为pH敏感材料的行为已有充分记载。此外，由于该检测方法是为蒸气检测而开发的，因此不存在像可浸入式水传感器那样的显著背景pH波动。因此，电极表面pH的变化完全归因于酶与甲基膦酸二甲酯（DMMP）的特异性相互作用。AChE活性可以通过其天然底物乙酰胆碱或乙酰硫代胆碱（ATCh）来监测，而有机磷化合物会干扰此过程。当AChE水解ATCh时，会产生硫代胆碱和乙酸。硫代胆碱是一种电活性分子，可以在相对较低的电位下被氧化，从而在电极表面产生可读的电子数量变化。反应方案显示在图1b-c中，并与代表性的电化学信号相关联，这将在后文讨论。
酶动力学
对PTE和AChE的酶动力学进行了研究，以揭示其生化机制和操作。PTE的酶动力学通过使用模型底物对氧磷进行分析进行研究。请注意，对氧磷是一种有机磷化合物，并且由于其反应产物（对硝基苯酚）的吸光特性，是光学方法的模型底物，与DMMP不同。根据既定方案，使用动力学速率计算速率常数和效率。通过将PTE与浓度范围从23.4 μM到3000 μM的对氧磷进行分析，测定基线动力学速率，对氧磷会形成对硝基苯酚。通过监测在405 nm波长下生成的对硝基苯酚的吸光度来确定初始反应速率。通过分析增加浓度的对硝基苯酚的吸光度构建了标准曲线（图S1a）。从每个对氧磷浓度的进程曲线（图S1b）的线性部分提取初始酶反应速率，并产生了图2a中的米氏曲线。基于PTE的米氏模型，确定最大反应速率（Vmax）和米氏常数（KM）分别为6 ± 1 nM sec–1和0.6 ± 0.2 mM。获得的催化效率（kcat= Vmax/[E]）为0.39 ± 0.04 s–1，酶效率（kcat/KM）为0.6 ± 0.2 mM–1s–1。报道的光学数据证实了突变PTE可以水解对氧磷，适合后续的电化学集成。
以类似的方式，用其底物ATCh对AChE进行分析。反应副产物硫代胆碱与5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反应生成5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB），其在412 nm附近呈现吸收峰。使用比尔-朗伯定律（公式S1）量化该反应产物的形成，该定律将吸光度（A）、消光系数（ε）、光程（b）和产物浓度（C）联系起来。ε值为13,600 M–1cm–1，如他人所报道。在存在DTNB的情况下，用AChE和浓度递增的ATCh进行分析，从进程曲线（图S1c）的斜率确定初始反应速率。米氏曲线（图2b）显示了Vmax、KM、kcat和酶效率分别为17.0 ± 0.9 nM sec–1、0.18 ± 0.01 mM、3.4 ± 0.2 s–1和19.0 ± 1.7 mM–1s–1。获得的光学结果证实了AChE的活性以及ATCh的转化，这将在后续的电化学实验中因有机磷蒸气暴露而受到抑制。
电化学表征
通过使用一系列电化学技术，包括开路电位法（OCP）、电化学阻抗谱（EIS）、循环伏安法（CV）和安培法（i-t），对电极材料和酶功能化步骤进行了评估。通过将pH为4、7和10的缓冲液滴铸到传感表面来评估RuO2电极的pH传感能力，随着H+离子减少，电位随之降低（图3a）。电极与板边连接器的连接以及设备方向如图S2所示。电极平行于地面操作并朝上，以确保溶剂保留在传感表面。例如，垂直于地面的电极可能由于重力导致溶剂滴落。金属氧化物的pH传感机制已得到充分证实，并被认为是由于金属氧化物的较高和较低价态，或者是由于电极表面层含有OH基团发生离子交换所致，这取决于溶液中的H+/OH–平衡（即pH）。线性回归得出的斜率为-0.166 ± 0.013 V pH–1，虽然这超过了-0.059 V pH–1的能斯特理论极限，但获得的仪器灵敏度是定制恒电位仪组件执行缓冲、滤波和增益步骤的结果。简而言之，在电极表面获取的原始数据首先由于初始的高阻抗测量而被缓冲。信号经过滤波以抗混叠并消除环境噪声。最后，信号通过定制恒电位仪的增益进行放大，从而得到报告的仪器输出和灵敏度。
为了电化学分析酶修饰的磁珠，进行了EIS以阐明电极表面的电荷转移。EIS技术产生关于阻抗对所施加电压频率依赖性的信息，当阻抗的负虚部对实部作图时，可以显示一个半圆函数。该信号的感知直径归因于电荷转移电阻（Rct）。如图3b所示，当RuO2电极修饰未功能化的磁珠时，Rct从24.2 Ω增加到35.4 Ω。Rct增加了46.2%，证明了磁珠本身对电极表面的贡献。当修饰酶功能化的磁珠时，获得的Rct为48.3 Ω。与裸电极相比增加了99.9%，表明磁珠和酶都导致了电荷转移的变化。其他研究人员已经进行了类似的研究，通过增加的Rct来确认酶/抗体在纳米多孔金叶、丝网印刷石墨烯和铅笔石墨电极上的成功功能化。我们的观察结果证实了功能化磁珠成功吸附在电极表面，使传感器能够进行目标分析。为了验证传感器操作，进行了DMMP顶空研究（图3c），其中OCP信号的增加证实了PTE成功水解DMMP蒸气，导致pH降低。
类似地，对AChE修饰的碳SPE进行了表征，其活性最初通过与其天然底物ATCh的分析进行测试。将功能化的碳SPE与10 mM ATCh孵育10分钟，使AChE水解ATCh，产生硫代胆碱和乙酸。进行CV扫描（图3d），当电位超过0.4 V时，出现阳极电流，并在0.6 V处形成氧化峰。与裸碳SPE在0.1 M Tris中的CV扫描相比，阳极信号的升高表明AChE成功水解了ATCh，并随后对硫代胆碱进行了电化学氧化。进行了对照实验，将未功能化的磁珠滴铸到碳SPE上并在10 mM ATCh中扫描，结果没有产生显著信号。该对照证实任何产生的信号必须归因于AChE的存在。同样，EIS阐明了磁珠和酶的修饰。当未功能化的磁珠滴铸到碳SPE上时，观察到Rct增加了9.2%。相比之下，当碳SPE用酶功能化的磁珠修饰时，观察到Rct有更大的增加，导致增加了45.7%，证实了电极修饰的成功。对顶空研究进行了i-t实验，验证了暴露于DMMP蒸气后AChE和ATCh之间反应受到抑制，相应地阳极电流减少，因为更少的ATCh被转化为电活性产物（图3f）。通过这些电化学技术，证明了PTE和AChE修饰电极的传感原理。
酶交联的电化学评估
通过研究电极上磁珠结合的酶的电化学确定的酶条件和动力学。分别为PTE和AChE修饰的电极生成了OCP和安培曲线。通过改变化学交联剂（BS3）的浓度，证明了多点共价连接的效果。每种酶的晶体学图像显示了赖氨酸表面残基，这些是可能发生多点共价连接的位置（图S3）。PTE和AChE的BS3浓度范围从1到100 mg mL–1，这些浓度足以根据供应商建议的程序和酶表面游离胺的可用性，将酶拴系或实质性交联到磁珠上。通过顶空对DMMP的响应来监测PTE的行为（图4a）。BS3交联处理效果的比较显示在图4b中。最低的交联剂浓度处理（1 mg mL–1BS3）产生了足够的信号（80.9 ± 40.8 mV）。当交联剂浓度增加到50 mg mL–1BS3时，获得了可比较的信号（95.5 ± 46.5 mV）。两种处理变化不显著。相反，最高交联剂浓度处理（100 mg mL–1BS3）产生了最低的信号（12.4 ± 10.2 mV）。很明显，1和50 mg mL–1BS3在磁珠表面负载了足够的PTE，并保持了优化酶性能所需的适当构象变化。当BS3浓度增加到100 mg mL–1时，OCP信号强度急剧下降。这种活性的降低表明酶可能在其构象运动中受到限制，或者PTE-磁珠形成了大的聚集体，无法充分转化产生可电化学读取的产物。底物解离是PTE酶活性的限制步骤。如果聚集体变得太大，另一种可能性是底物从磁珠-PTE复合物上解离减少，从而导致底物抑制。这些假设需要在未来的研究中进一步探讨，以探究交联程度与酶功能之间的复杂关系。
此外，通过ATCh的剂量反应来监测AChE的行为（图5a）。每个BS3浓度的单独i-t扫描见图S4。最低限度结合的酶（1 mg mL–1BS3）显示出最低的灵敏度（128 μA M–1）。对于所有处理，反应在接近30 mM的浓度时接近饱和（图5b）。使用10 mg mL–1BS3结合的AChE表现出比1 mg mL–1BS3处理更高的灵敏度（178 μA M–1），推测是由于磁珠上酶负载量的增加。然而，当BS3浓度增加到100 mg mL–1时，酶灵敏度下降到154 μA M–1。虽然灵敏度仍然高于1 mg mL–1的条件，并且表明有足够的酶负载量，但与10 mg mL–1条件相比灵敏度的降低可以解释为可用酶表面胺的实质性交联导致了略微受限的构象。所描述的条件表明酶的构象受到更多限制，导致活性减弱，这与多点共价固定的概念一致。需要注意的是，PTE和AChE上类似的BS3处理并未遵循相同的趋势，这是由于构象运动、可用附着残基和结构的差异。
分析条件
各个分析包含影响整体传感机制的组分，应进行研究。作为对DMMP暴露的响应，进一步评估了分析条件。关于PTE分析，形成了PBS和DES的混合物。使用PBS是为了保护酶免受水解反应引起的快速pH变化的影响。然而，PBS的强度不能太浓，以免完全缓冲pH变化并限制后续的OCP信号。因此，在PTE功能化电极上进行了DMMP暴露实验，使用了不同强度DES和PBS制备的不同混合物（图S5a）。随着缓冲液浓度从5 mM降低到1 mM，使用1 mM PBS处理观察到了对DMMP的最大化响应。例如，缓冲良好的5 mM PBS薄膜在暴露于DMMP后产生101.9 ± 24.7 mV的响应，而稀释的1 mM PBS缓冲液对DMMP产生223.8 ± 23.4 mV的响应（图S5b）。因此，将DES/PBS薄膜的缓冲强度保持在1 mM以提高蒸气检测信号。
由于AChE修饰的电极是竞争性分析（即ATCh和DMMP竞争AChE结合位点），进行了一项研究，以调整传感器对DMMP的响应作为ATCh浓度的函数（图S6a）。选择了3、7.5和15 mM的ATCh浓度，因为酶分析最好在KM或低于KM的浓度下进行，以便对抑制性底物具有更高的灵敏度。表观KM值在每个BS3处理中取平均值，根据图S7中的米氏模型近似为15.4 ± 0.1 mM；因此，选择的3、7.5和15 mM ATCh浓度是合适的。传感器对7.5和15 mM ATCh的DMMP响应相似，电流变化分别为0.14 ± 0.03和0.16 ± 0.03 μA（图S6b）。3 mM ATCh浓度产生的响应最低，为0.05 ± 0.01 μA。就ATCh信号被抑制的百分比而言，3、7.5和15 mM ATCh处理在DMMP暴露后分别对应于41.7%、39.1%和43.2%的抑制（图S6c）。尽管3 mM ATCh的情况产生了与其他情况相似的抑制，但这种处理并不吸引人，因为对ATCh的初始电流响应低于其他情况。分析中的这种特性将导致有限的线性传感范围，因为抑制窗口更小。由于15 mM大约是表观KM，因此选择该浓度用于AChE
