《Frontiers in Immunology》：Assessing the endothelium’s role in COVID-19 severity using the HUVEC model
引言
冠状病毒病2019（COVID-19）已被广泛认为与强烈的系统性炎症、内皮损伤和高血栓并发症发生率相关，这些因素共同导致疾病严重程度增加和不良临床结局。虽然内皮功能障碍、细胞因子产生失调和氧化应激是重症COVID-19的公认特征，但来自感染个体循环因子对内皮细胞行为的直接影响仍未充分表征。本研究利用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为体外模型，探讨了重症COVID-19患者和康复期个体血清如何调节内皮激活、炎症反应和氧化应激。
方法
在COVID-19大流行初期，从重症COVID-19个体（n = 13）、康复期患者（n = 11）和健康志愿者（n = 7）采集静脉血样本。HUVEC在血清剥夺一段时间后，暴露于各研究组15%的血清中。通过定量实时PCR在特定时间点分析与内皮激活、血栓形成、炎症和氧化应激相关的基因表达。此外，使用多重微珠免疫分析法评估细胞培养上清液中的内皮分泌谱。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）及适当的事后检验、受试者操作特征（ROC）曲线分析以评估生物标志物的区分能力，以及多元线性回归以确定与疾病严重程度相关的因素。
结果与讨论
我们研究了内皮在调节重症COVID-19细胞因子风暴中的作用。用重症COVID-19患者、康复期个体和健康志愿者的血清刺激HUVEC。重症病例血清刺激在60分钟内诱导VCAM1、F3、PROCR、IL6、IL12A、NFE2L2、HMOX1、GPX1和GSR表达显著增加。抗氧化基因SOD1和CAT在120分钟后上调。重症COVID-19血清刺激的HUVEC显示sICAM-1、sVCAM-1、P-选择素、sE-选择素、PECAM-1、组织因子、血栓调节蛋白以及多种细胞因子和生长因子水平升高，如IL-1α、IL-1Ra、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12(p40)、IL-18、IL-27、TNF-α、TGF-α、FGF-2、G-CSF、M-CSF、FLT-3L、fractalkine、eotaxin、MIG、IP-10、MIP-1β、MDC、GROa和PDGF-AB/BB。相比之下，康复期血清诱导的标记物较少，仅包括IL-12(p40)、IL-18、FGF-2、MIP-1β、MDC、GROa和PDGF-AB/BB，而健康志愿者血清诱导IL-12(p40)、IL-27、TNF-α、VEGF、MDC、eotaxin和GROa显著增加。ROC曲线分析显示，P-选择素和MIP-1β水平能清晰区分重症病例与健康志愿者。比较重症和康复组时，我们观察到IL-27、TGF-α、sVCAM-1、IL-1α和G-CSF水平升高。此外，多变量逻辑回归分析将疾病严重程度与IL-10降低以及MIP-1β、sICAM-1和P-选择素升高相关联。
重症COVID-19患者血清诱导HUVEC中内皮功能障碍、血栓形成、炎症和抗氧化反应相关基因的显著表达
基因表达分析显示，重症COVID-19患者血清在刺激60分钟后显著上调HUVEC中VCAM1、F3、PROCR、IL6和IL12A的表达。PROCR基因的增加最为显著。相比之下，康复期患者和健康志愿者血清未诱导这些基因。分析重症COVID-19血清对TNFA基因的影响时，我们注意到在孵育30分钟后该基因表达显著降低，60分钟后增加至与阴性对照相当，120分钟后再次显著降低。此外，这些血清刺激未引起EDN1表达的显著变化。
关于细胞抗氧化反应相关基因，重症COVID-19患者血清在刺激60分钟后促使NFE2L2、HMOX1、GPX1和GSR表达增加。SOD1和CAT的表达在刺激后较晚出现（120分钟后）。重症病例血清导致SOD1和CAT水平升高，而康复期患者血清也诱导SOD1和CAT增加。
重症COVID-19和康复期患者血清诱导HUVEC中内皮功能障碍和血栓形成相关标记物的产生
用重症COVID-19患者血清刺激的HUVEC上清液显示sICAM-1、sVCAM-1、P-选择素、sE-选择素、PECAM-1、组织因子和血栓调节蛋白水平相较于对照培养基升高。与健康志愿者血清相比，重症COVID-19患者血清显著增加HUVEC上清液中sICAM-1的产生。康复期患者血清特异性增强HUVEC中血栓调节蛋白的分泌。
重症COVID-19和康复期患者血清刺激HUVEC产生促炎细胞因子和介质
与对照培养基相比，用重症COVID-19患者血清刺激的HUVEC上清液显示一系列细胞因子显著增加，包括IL-1α、IL-1Ra、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12(p40)、IL-18、IL-27、TNF-α、TGF-α、FGF-2、G-CSF、M-CSF、FLT-3L、fractalkine、MIG、eotaxin、IP-10、MIP-1β、MDC和GROa。
相比之下，用康复期患者血清刺激的HUVEC上清液与对照培养基相比，细胞因子增加范围较有限， specifically IL-12(p40)、IL-18、FGF-2、eotaxin、MIP-1β、MDC和GROa。此外，康复期血清刺激导致IL-3水平显著降低。
与对照培养基相比，用健康志愿者血清刺激的HUVEC上清液中IL-12(p40)、IL-18、IL-27、TNF-α、VEGF、eotaxin、MDC、GROa和PDGF-AB/BB水平显著增加。
此外，与健康志愿者相比，重症COVID-19患者血清显著刺激IL-1ra和IL-10的产生。与重症COVID-19病例相比，康复期患者血清显示TGF-α和G-CSF产生减少。值得注意的是，与重症COVID-19患者血清相比，康复期血清在sICAM-1、sVCAM-1、P-选择素、IL-1α、IL-1ra、IL-10、IL-27、TNF-α、TGF-α和G-CSF方面显示显著降低。
评估生物标志物在区分健康状况中的效能
ROC曲线分析评估了生物标志物浓度在区分健康状况中的敏感性和特异性。比较重症组和健康志愿者，分析显示IL-1Ra、IL-10、sICAM-1、MIP-1β和P-选择素的曲线具有统计学意义。重症和康复组之间的比较也显示IL-1α、IL-1Ra、IL-10、IL-27、TGF-α、G-CSF、sICAM-1和sVCAM-1的曲线显著。
多元线性回归数据呈现。所提出的模型显著预测健康状况。调整后的R2为0.507，表明该模型解释了健康状况方差的50.7%。值得注意的是，IL-10水平降低与重症疾病显著相关，而MIP-1β、sICAM-1和P-选择素水平升高与重症疾病强烈相关。
讨论
研究结果表明，当用重症COVID-19患者、康复期个体和健康志愿者的血清刺激时，HUVEC表现出不同的反应，证明了内皮在机体对COVID-19反应中的关键作用。值得注意的是，重症COVID-19患者血清诱导HUVEC中与内皮功能障碍、血栓形成、炎症和抗氧化反应相关基因的显著上调。这表明重症COVID-19病例中存在强烈的内皮激活和功能障碍，这可能有助于这些患者中观察到的血栓栓塞和炎症并发症增加。
最初，我们评估了IL6、IL12A和TNFA的表达，这些是COVID-19相关细胞因子风暴中涉及的关键促炎基因。我们的结果显示，重症COVID-19患者血清在刺激60分钟内显著上调HUVEC中IL6和IL12A的表达。
虽然在此早期阶段TNFA表达没有显著增加，但我们注意到在重症和康复期患者血清刺激120分钟后，其表达相较于健康志愿者血清显著降低。此外，在后期时间点观察到IL6和IL12A表达的大幅下降。这种快速下降可能归因于mRNA的迅速合成及随后转化为蛋白质产物，说明患者血清在HUVEC中诱导的反应与健康志愿者血清诱导的反应明显不同。HUVEC上清液中IL-6、IL-12和TNF-α水平的增加进一步支持了我们关于COVID-19反应中炎症介质动态调节的假设。
重症COVID-19患者血清显著上调HUVEC中涉及细胞抗氧化反应的基因，包括NFE2L2、HMOX1、SOD1、CAT、GPX1和GSR。SOD1和CAT在120分钟后的较晚表达可能表明针对严重炎症诱导的氧化应激存在延迟但必要的抗氧化防御机制。NFE2L2（也称为NRF2）在细胞保护性应对氧化应激中起关键作用，尽管其对抗SARS-CoV-2感染的机制仍知之甚少。
NFE2L2和KEAP1的遗传变异可能通过修改这一保护通路的激活来影响急性肺损伤， potentially accounting for varying susceptibilities to different clinical stages of SARS-CoV-2 infection。这突出了维持NFE2L2完整性以触发抗氧化酶诱导的重要性，从而提供针对病毒促氧化损伤的细胞保护反应。
Catalase广泛分布于上皮细胞和白细胞等中，保护它们免受氧化损伤，调节细胞因子产生，并减缓SARS-CoV-2的复制。Mo等人表明，增强SOD产生可以防止再次暴露时浆细胞凋亡，并显著延长SARS-CoV特异性抗体产生。另一项研究显示，COVID-19患者血清中SOD和GPx浓度显著高于对照组，表明抗氧化反应被激活。相反，COVID-19患者中显著较低的GSR和升高的IL-10水平分别表明抗氧化能力和免疫功能存在缺陷。我们的数据显示HUVEC中存在不同的反应，GSR表达增加。支持这一发现，Naghashpour等人表明重症COVID-19患者血清强烈诱导GSR表达，强调了重症疾病阶段中增强抗氧化反应的潜在作用。
VCAM1、F3、PROCR、IL6和IL12A等基因在刺激60分钟内表达升高，表明对内皮对COVID-19感染诱导的严重炎症状态存在急性快速反应。康复期患者和健康志愿者血清未诱导基因表达，突显了重症COVID-19所呈现的独特病理环境，这种环境似乎在疾病急性期之后仍然存在。
可溶性标记物如sICAM-1、sVCAM-1、P-选择素、sE-选择素、PECAM-1、组织因子和血栓调节蛋白的产生进一步说明了广泛的内皮激活以及血管通透性增加和血栓形成的潜力。这在重症病例与康复期患者相比尤为显著，后者仅血栓调节蛋白显示显著增加。
研究发现轻度COVID-19患者血液中血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和ICAM-1水平升高，重症病例中 dramatically elevated，并在康复期下降。这一趋势可能解释了本研究中相应基因表达的增加。促炎细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α已知可在免疫和非免疫细胞中诱导F3基因表达，可能有助于COVID-19患者，尤其是重症病例中观察到的血栓栓塞事件。此外，一项荟萃分析显示，组织因子水平与COVID-19患者的衰老和高凝基因特征呈正相关。这项研究强调了组织因子作为呼吸系统病毒感染中炎症、血栓形成和衰老之间关键联系的作用。
独特的细胞因子谱，其特征在于重症COVID-19患者血清刺激的HUVEC上清液中促炎细胞因子水平升高，表明存在过度活跃的炎症反应，可能加剧内皮损伤和功能障碍。这种过度活跃与康复期患者血清刺激的HUVEC中观察到的更受限制的细胞因子产生形成对比，表明炎症反应逐渐消退。
HUVEC大量表达PROCR基因，该基因编码内皮蛋白C受体（EPCR）。EPCR与抗凝和抗炎作用相关，调节止血和炎症。一些研究报告称，PROCR基因突变与血栓形成的发展有关。EPCR是蛋白C抗凝途径的重要控制器，与蛋白C结合并增强其被血栓调节蛋白-凝血酶复合物的激活。
Won等人最近的一项研究表明，死于重症COVID-19患者的肺内皮细胞中冯·维勒布兰德促凝血因子（VWF）表达增加，而抗凝血血栓调节蛋白和EPCR表达减少。虽然我们未在培养上清液中测量EPCR，但PROCR基因表达的显著增加表明危重患者通过诱导抗血栓系统来补偿COVID-19中的血栓形成状态。
我们随后评估了血清刺激的HUVEC上清液中的细胞因子水平。重症COVID-19患者血清诱导IL-1α、IL-1Ra、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12(p40)、IL-18、IL-27和TNF-α水平升高。
先前的报告表明，COVID-19的发病机制由涉及多种介质的强效炎症反应支持，如IL-6和IL-10。这些多效性细胞因子在炎症部位由不同细胞类型产生，包括淋巴细胞、内皮细胞和上皮细胞，并在脓毒症和急性器官损伤期间释放到循环中。此外，IL-6、IL-12和TNF-α是经典已知具有促炎特性的细胞因子，在COVID-19中升高。使用不同程度严重程度COVID-19患者血清进行的研究表明，患者这些标记物水平较高。我们的结果证实了这些发现，表明内皮细胞可能响应严重条件下SARS-CoV-2感染患者血清的刺激而有助于这些细胞因子的产生。先前的研究表明，内皮细胞在感染后可以产生细胞因子。
尽管任何血清均未显示TNFA表达显著增加，但HUVEC上清液测定结果显示，重症COVID-19患者血清显著诱导TNF-α的产生。基于此信息，可以推测TNFA基因的表达可能在刺激后不久发生，随后产生细胞因子。
Shao等人表明，人乳腺上皮细胞（HMEC）对后续MERS-CoV-2感染具有训练免疫，这有助于上调促炎细胞因子基因，如TNFA、IL6、CSF1、CSF3和IL32（训练免疫标记物），并表明受感染HMEC中的训练免疫可产生细胞因子风暴。
IL-1α水平升高与重症COVID-19患者的肺损伤相关。相比之下，IL-1Ra是IL-1细胞因子家族的成员，由各种细胞类型分泌，包括上皮细胞、免疫细胞、肝细胞、角质形成细胞和成纤维细胞。它作为IL-1β促炎作用的天然抑制剂，并与COVID-19的严重程度和进展显著相关。
Han等人表明，高水平的细胞因子风暴与疾病严重程度直接相关，并与IL-6相关，表明这些标记物可用作快速诊断疾病严重程度较高风险患者的预测指标。相比之下，IL-10是一种Th2型细胞因子，在不同细胞类型中表现出针对IL-6、IL-1β、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的抗炎作用，通过阻断IL-12的产生来阻止树突状细胞成熟。
IL-18参与Th1和自然杀伤（NK）细胞的激活，在IL-12或IL-15存在下能够诱导IFN-γ。IL-18作用于CD4、CD8和NK细胞以诱导IFN-γ产生。此外，巨噬细胞在IL-18和IL-12激活时可产生IFN-γ。
IL-27具有双重作用，既能够刺激表达IFN-γ的Th1细胞分化，也能刺激产生IL-10的T细胞。IL-27作用于多种细胞类型，包括T细胞和B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞和非造血细胞。Th1细胞的扩增通过转录介导的T-bet信号转导和转录激活因子（STAT）1信号通路发生。相比之下，IL-27也通过抑制Th17细胞发育和以STAT1和STAT3依赖性方式诱导IL-10产生来抑制免疫反应。循环IL-27水平与重症COVID-19患者的严重程度和较差预后呈正相关。Xu等人在最近的一项研究中表明，血清IL-27水平与肺炎患者的严重程度和不良预后呈正相关，表明IL-27可能参与该疾病的病理生理过程。因此，这些数据表明IL-27可能参与炎症性肺病的发病机制。
在SARS-CoV-2感染个体中，Th1和Th2细胞因子均升高，Wolf等人报告在SARS-CoV-2感染早期持续升高1型干扰素、Th1和Th2白细胞介素以及趋化因子的表达。观察到的IL-5水平升高证实了Montazersaheb等人的发现，他们报告了COVID-19严重程度与T细胞减少之间的相关性。这导致Th2衍生细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的过度表达。
先前的研究表明，FGF2参与MERS-CoV诱导的强烈凋亡反应，这对肺部裂解周期中复制增加的发展至关重要。此外，FGF2在套叠式血管生成中起作用，并由于疾病中显著的炎症过程和缺氧而诱导血管生成。Meini等人表明，套叠式血管生成可能具有恢复功能性血管丛的功能，该血管丛源于COVID-19中广泛的内皮炎和肺泡毛细血管微血栓形成。
Fractalkine（CX3CL1）是一种由激活的内皮响应促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β）刺激而产生的趋化因子，并作为内皮功能和功能障碍（包括血栓形成）的重要调节剂。CX3CL1可能在SARS-CoV-2感染期间在内皮中上调，并有助于促血栓形成周期的持续。
MIG（CXCL9）和IP-10（CXCL10）参与Th1、CD8和NK细胞迁移，并在SARS-CoV-2感染后早期上调。轻度症状和重症患者中检测到较高的MIG水平，高于无症状患者。IP-10由激活的支气管和肺泡上皮细胞产生，与凋亡、淋巴细胞减少症的发展和中性粒细胞浸润有关，其水平随疾病严重程度或死亡而增加。
研究表明，死于COVID-19的患者与重症和/或轻度COVID-19患者相比，血浆中CX3CL1、CXCL9和CXCL10等水平升高。
Flt-3L配体是一种造血细胞因子，刺激几种血细胞祖细胞的增殖和分化，并且是刺激树突状细胞生长的重要生长因子。
总之，重症COVID-19患者血清显著诱导与内皮功能障碍、血栓形成、炎症和氧化应激相关基因的表达。相反，康复期血清表现出与健康志愿者相似的表达谱，在所评估的时间点目标基因表达没有显著增加，除了组织因子基因的轻微但显著诱导。
此外，重症病例血清刺激的HUVEC上清液中细胞因子、趋化因子和炎症相关生长因子的存在 substantially higher than those from convalescents and healthy volunteers。
具体而言，与健康志愿者相比，重症COVID-19患者血清刺激的HUVEC上清液中P-选择素和MIP-1β水平升高。比较重症和康复组时，我们观察到IL-27、TGF-α、sVCAM-1、IL-1α和G-CSF升高。ROC曲线结果分析揭示了重症COVID-19患者与健康志愿者和康复组之间的共同标记物，包括IL-1Ra、IL-10和sICAM-1，作为以高敏感性和特异性区分健康状况的诊断工具。
此外，多元线性回归分析 reinforced the significance of IL-10, MIP-1β, sICAM-1, and P-selectin as indicators of disease severity。IL-10降低以及MIP-1β、sICAM-1和P-选择素升高与疾病严重程度增加相关，强调了这些标记物在理解和管理COVID-19中的关键重要性。
结论
基于我们的发现，HUVEC在响应COVID-19患者血清刺激时显示出作为生物传感器的显著潜力。这些细胞有助于产生细胞因子、趋化因子和生长因子，这些因子在疾病血清中存在的炎症介质引发的炎症反应、氧化应激和促凝状态中至关重要。这突出了内皮在COVID-19病理生理中的核心作用，强调了其在疾病进展和潜在治疗靶向中的重要性。
