《Frontiers in Environmental Science》：Analysis of soil microbial diversity of Miscanthus lutarioriparius communities in different areas of Dongting Lake
1 引言
土壤微生物是湿地生态系统过程的关键驱动者，调控着养分循环和能量流动。在具有水陆交错特征的湿地中，水文条件被认为是影响土壤微生物群落的主要因素。地形变化（常以海拔为代理指标）塑造了洪水频率和持续时间等水文情势，从而产生显著改变土壤微生物组结构和多样性的生境异质性。此外，土壤的理化性质，包括pH、养分有效性（如总氮TN、总磷TP）和有机质（SOM）含量，也是微生物群落组成的关键决定因素。理解这些环境过滤器之间的相互作用对于预测生态系统功能至关重要。
洞庭湖是中国第二大淡水湖，是长江流域重要的湿地系统。其复杂的水文连通性和地形导致土壤特征存在显著的时空异质性。以南荻（Miscanthus lutarioriparius）为优势种的群落是这些湿地中的主要挺水植物群落，因其强大的繁殖能力和适应性而发挥着关键的生态作用。虽然此前洞庭湖的微生物研究多集中于上游水文、三峡大坝或杨树林生态恢复的影响，但针对南荻群落相关土壤微生物群落的专门研究仍然匮乏。
此外，中国其他湿地（如鄱阳湖、三江平原、黄河三角洲）的微生物生物地理学研究已建立了水文、养分与微生物之间的明确联系。然而，本研究的新颖之处在于其聚焦于一个由单一生态优势种（南荻）定义的植物群落，并在一个湖泊系统内的异质景观中进行考察。这种对特定、单优势群落类型的聚焦，能够更清晰地解析环境梯度如何塑造相关的微生物群，从而在很大程度上控制了植物物种组成变化的潜在混杂影响。
为填补这一知识空白，本研究系统采集了洞庭湖七个区域南荻群落的土壤。我们假设：（1）土壤细菌和真菌群落的组成和多样性在不同区域间会表现出显著的空间异质性；（2）细菌群落将更强烈地受水文梯度（以海拔为代理）影响，而真菌群落则对土壤养分状况（如TP、TN、SOM）更敏感；（3）域间和域内微生物相互作用将反映这些对环境过滤器的差异响应。
本研究的目标是：（1）表征洞庭湖南荻群落相关土壤细菌和真菌群落的组成和多样性模式；（2）识别观测到的微生物群落模式背后的关键环境驱动因子；（3）揭示细菌和真菌类群之间的共现模式。通过验证这些假设，本研究旨在阐明植物-微生物-环境相互作用，为洞庭湖湿地的保护和恢复提供科学依据。
2 材料与方法
2.1 研究区域与采样
2.1.1 研究区域
基于湖南省南荻资源生态化利用工程实验室对南荻群落时空分布的研究，本研究在洞庭湖区域选取了七个南荻群落连年集中稳定生长的区域进行采样。采样点包括岳阳（A）、六门闸（B）、新洲（C）、漉湖（D）、沅江（E）、安乡（F）和澧县（G），覆盖了洞庭湖的东、南、西部。
2.1.2 采样方法
采样于2023年10月进行。在七个采样点各设置三个独立的重复样地（每个5 m × 5 m，相距至少10 m），共获得21份土壤样品。在每个样地内，清除地表凋落物后，采用五点采样法，使用不锈钢土钻采集0–20 cm深度土层的土壤芯。同一样地的五个子样品充分混合形成一个复合样品。复合样品立即放入带有冰盒的冷藏箱中运回实验室。去除可见植物残体和石块后，每个样品过2 mm筛，分装用于DNA提取和土壤理化分析，并分别保存在-80 °C和4 °C下。
2.2 DNA提取与高通量测序
使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit从约0.5 g土壤中提取总基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的浓度和纯度。DNA样品保存于-80 °C直至使用。使用引物343F和798R扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区。使用引物ITS1F和ITS2扩增真菌内转录间隔区（ITS1）。PCR反应体系为20 μL。扩增条件包括：95 °C预变性3分钟；27个循环的95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸45秒；最后72 °C延伸10分钟。PCR产物纯化后，在Illumina MiSeq平台上进行双端测序。
2.3 生物信息学处理与OTU聚类
使用fastp对原始测序 reads 进行质控过滤。使用FLASH合并双端reads。使用USEARCH中的UPARSE算法，以97%的相似性阈值聚类操作分类单元（OTU）。使用UCHIME去除嵌合序列。使用RDP Classifier对每个OTU的代表序列进行物种分类注释（细菌对照SILVA 138数据库，真菌对照UNITE 8.0数据库），置信度阈值为0.7。在进行α和β多样性分析前，将所有样品抽平至相同的测序深度。
2.4 土壤理化性质测定
测定土壤pH、电导率（EC）、有机质（SOM）、有效磷（AP）、全磷（TP）、碱解氮（AHN）、全氮（TN）、速效钾（AK）、全钾（TK）等指标。测定方法参考鲍士旦（2000）的《土壤农化分析》。
2.5 数据统计分析
计算Chao1、ACE（丰富度估计值）、Shannon、Simpson（多样性指数）等α多样性指数。使用单因素方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis检验评估采样点间指数和土壤性质的差异。基于Bray-Curtis距离矩阵，使用置换多元方差分析（PERMANOVA）评估区域间微生物群落结构（β多样性）的差异。使用基于距离的冗余分析（db-RDA）检验整体微生物群落结构与单个环境因子之间的相关性。使用Spearman秩相关分析环境因子与微生物α多样性指数、以及与最丰富OTU相对丰度之间的关系。使用最丰富的细菌和真菌OTU构建共现网络。使用BugBase预测细菌表型，使用FUNGuild数据库注释真菌功能群。
3 结果与分析
3.1 不同区域南荻群落土壤微生物结构差异
3.1.1 细菌结构组成分析
七个研究区域土壤细菌门水平（平均相对丰度>1%）的相对丰度显示，最丰富的十个细菌门为酸杆菌门（Acidobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）等，它们共同占细菌序列总数的89.21%。酸杆菌门和变形菌门是所有区域的优势门。除沅江（E点）外，酸杆菌门是其他所有区域的优势门，而沅江点变形菌门的相对丰度最高。Kruskal-Wallis检验表明，门水平细菌群落组成存在显著差异，但经过错误发现率（FDR）校正后，仅迟发型杆菌门（Latescibacterota）的相对丰度在区域间存在显著差异。
3.1.2 真菌群落组成分析
不同区域土壤真菌门水平（平均相对丰度>1%）的组成显示，主要门包括担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）、未分类真菌（unclassified k__Fungi）、被孢霉门（Mortierellomycota）等。担子菌门是大多数研究区的优势门。相比之下，子囊菌门在沅江研究区（E点）的相对丰度最高。Kruskal-Wallis检验显示，经过FDR校正后，主要真菌门相对丰度在区域间无统计学显著差异，表明门水平真菌群落在所研究的空间梯度上组成相对均质。
3.2 不同区域南荻群落土壤微生物多样性分析
3.1.1 细菌和真菌α多样性分析
细菌多样性指数分析显示，Kruskal-Wallis检验表明四个指数中的三个（ACE、Chao1、Shannon）在七个区域间无显著总体差异。探索性两两比较发现，ACE指数在六门闸区与漉湖、安乡区之间存在显著差异，与澧县区存在极显著差异。Chao1指数也呈现类似模式。Shannon指数在六门闸与岳阳区之间存在显著差异，与漉湖区存在极显著差异。Simpson指数的组间差异显著，事后检验揭示了沅江区与岳阳、新洲、漉湖、安乡区之间的特定两两差异，以及漉湖与安乡区之间的差异。
真菌多样性指数方差分析显示，四个指数在区域间均无显著总体差异。探索性两两比较发现，Shannon指数在六门闸与澧县区之间存在显著差异。Simpson指数在六门闸区与新洲、澧县区之间存在显著差异。
3.2.2 细菌和真菌β多样性分析
基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示，细菌群落的前两个主坐标（PC1和PC2）分别解释了32.67%和14.97%的方差。岳阳（A）、六门闸（B）、新洲（C）、漉湖（D）和安乡（F）的样品显示出相当大的重叠，表明这些位点细菌群落组成相似。相比之下，澧县（G）的样品在第三象限单独聚类，而沅江（E）的样品独立分布在第二和第三象限之间，表明这两个地点的细菌组合不同。PERMANOVA证实区域间细菌群落结构存在显著差异。
对于真菌群落，PC1和PC2分别解释了25.42%和13.31%的方差。岳阳（A）、六门闸（B）、漉湖（D）和安乡（F）的样品聚集在一起，表明组成相似。沅江（E）和澧县（G）的样品在第一象限形成一个单独的簇，而新洲（C）的样品在第四象限孤立，证明了真菌群落结构的空间异质性。PERMANOVA证实区域间真菌群落组成存在显著差异。
3.3 不同区域环境因子变化
土壤理化性质分析揭示了洞庭湖湿地七个采样区域显著的空间异质性。在测量的十个参数中，pH和AP在区域间无显著差异。相比之下，EC变化显著。关键的是，大多数土壤养分因子表现出高度显著的空间变异，包括TP、AHN、TN、SOM、AK、TK和TC。新洲区（C点）尤其独特，显示出TP、AHN、TN、SOM和AK等多个参数的最高浓度。此外，采样点海拔梯度从25米到37米。几个关键土壤性质（如SOM、TK）的变化似乎与这个海拔梯度相对应，为湿地景观中假设的水文变化提供了一个可量化的代理指标。
3.4 土壤微生物多样性与环境因子的相关性
综合分析揭示了洞庭湖南荻群落土壤微生物多样性与环境因子之间的显著关系。分析表明细菌和真菌群落对环境梯度的响应模式不同。
对于细菌群落，海拔（ALT）是一个关键因子，Ace指数和Chao指数均显示与其呈显著正相关，表明高海拔处物种丰富度增加。然而，Shannon指数与ALT呈显著负相关，表明随着海拔升高多样性均匀度降低。最值得注意的是，Simpson指数与TK含量呈极显著负相关，反映了钾有效性对优势细菌物种分布的强烈影响。
相比之下，真菌群落显示出对磷有效性的主要依赖，Ace指数和Chao指数均与TP呈极显著正相关，表明磷是真菌物种丰富度的关键决定因子。这些发现共同确定了TP、TK和ALT为最具影响力的环境因子，突出了细菌和真菌群落对环境梯度的差异响应及其在该湿地生态系统中的不同生态策略。
3.5 优势OTU与环境因子的相关性分析
为阐明优势微生物类群对环境梯度的响应模式，进行了优势OTU相对丰度与关键土壤理化性质之间的Spearman相关性分析。经过FDR校正后，没有一个优势细菌OTU与任何测量的环境因子显示显著相关。相比之下，几个真菌OTU表现出显著相关性。具体而言，OTU886的相对丰度与TN、SOM和TK呈显著正相关。OTU2332的相对丰度与TP呈显著负相关。此外，OTU2288的相对丰度与TK呈显著负相关。
总之，在OTU水平上并经过严格的统计控制，优势细菌OTU的丰度与测量的环境变量没有线性关联。相比之下，特定优势真菌OTU的丰度与主要土壤养分（包括TN、SOM、TP和TK）的有效性显著相关。这强化了真菌群落在该生态系统中对土壤养分梯度更直接响应的发现。
3.6 土壤微生物群落组成与环境因子的RDA分析
基于距离的冗余分析（db-RDA）用于评估土壤微生物群落与环境因子之间的关系。分析将环境变量视为解释因子，微生物群落组成视为响应变量，揭示了细菌和真菌群落的明显不同模式。
对于门水平细菌群落，环境因子解释了总方差的27.71%，其中海拔（ALT）、pH和碱解氮（AHN）表现出显著相关性。对于真菌群落，测量的变量解释了总方差的37.98%，全钾（TK）成为最具影响力的因子，其次是全磷（TP）、全氮（TN）和土壤有机质（SOM）。细菌和真菌群落之间差异的解释力突出了它们对环境梯度 distinct 的生态响应，细菌群落更多地受海拔和pH等非生物因子影响，而真菌群落显示出对养分有效性的更强依赖性。
3.7 细菌-真菌共生网络分析
为了可视化优势微生物类群之间的潜在关联，基于Spearman相关分析构建了一个共现网络。为确保稳健性，应用了|r| ≥ 0.8且FDR校正后P < 0.05的严格阈值。
所得网络包含156个节点和487条边。网络内，正相关（354条边，72.7%）显著多于负相关（133条边，27.3%）。网络表现出模块化结构（模块性=0.515）和中等聚类系数（0.429）。值得注意的是，在真菌子集中，按度中心性排名前十的枢纽节点均属于子囊菌门（Ascomycota），而细菌子集中度最高的节点主要由酸杆菌门（Acidobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria）主导。这表明子囊菌门主导真菌子网络，而酸杆菌门和变形菌门主导细菌子网络。
3.8 细菌表型与真菌功能群的功能预测
为了更深入了解微生物群落的潜在生态功能和适应策略，本研究使用BugBase对细菌群落进行了表型分析，并使用FUNGuild数据库注释了真菌群落的功能群（排除分类为‘Unknown’的序列以聚焦于生态上可解释的性状）。
预测的细菌群落表型谱显示，生物膜形成（Biofilm Formation）和革兰氏阴性（Gram-negative）细胞壁被确定为所有采样点两个最主要的表型。这表明细菌群落普遍通过聚集生长和特定细胞壁结构来适应波动的湿地环境。在需氧表型方面观察到清晰的空间模式。位于最高海拔的沅江点显示出最高的需氧（Aerobic）表型相对丰度和同时最低的厌氧（Anaerobic）表型丰度，为氧化还原梯度过滤提供了证据。此外，与移动遗传元件（Mobile Genetic Elements）相关的表型丰度在沅江点明显高于其他点，暗示潜在独特的环境压力影响了遗传适应性。
真菌功能群的注释（排除‘Unknown’分配）显示出明显的空间异质性。在所有点位，未定义腐生菌（Undefined Saprotrophs）和内生-凋落物-腐生菌（Endophyte-Litter-Saprotrophs）的功能群始终是核心组成部分，突出了真菌在分解中的基础作用。然而，不同的点位以不同的优势功能群为特征。新州点显示出较高比例的内生-病原-未指定（Endophyte-Pathogen-Unspecified）真菌，而安乡点主要与粪-植物腐生菌（Dung-Plant Saprotrophs）相关。相比之下，沅江和澧县点的真菌群落绝大多数由内生-凋落物-腐生菌主导。沅江点的功能谱尤其独特，几乎不含植物病原体（Plant Pathogens）而高度富集腐生功能群。这种模式与该点子囊菌门的分类学优势一致，并支持了当地植物凋落物化学是真菌功能组装关键驱动因素的推断。
4 讨论
4.1 微生物群落组成和多样性的变化
洞庭湖南荻群落相关土壤微生物群落存在空间异质性，但细菌和真菌群落对这种异质性表现出明显不同的响应模式。这与已建立的范式一致，即生境异质性，特别是由水文驱动的异质性，是构建湿地微生物组的主要力量。在洞庭湖，地形梯度（海拔25-37米）可能是水文情势（如洪水频率和持续时间）变化的关键代理指标。我们的结果支持这样的假设，即这种水文介导的生境过滤对细菌群落是更强的驱动因子，而真菌群落在空间梯度上更稳定。
细菌α多样性（Chao1和ACE指数）与海拔（ALT）呈显著正相关，证实了关于空间异质性的第一个假设。像六门闸（B）这样的低海拔点位，可能经历更长的淹没期，其细菌丰富度显著低于高海拔点位。这种模式与整个湿地生态系统的发现一致，其中长期积水产生的厌氧条件抑制了好氧和兼性厌氧细菌的多样性，导致群落由较少、特化的厌氧类群主导。与海拔的正相关表明，湿地内排水更好、海拔更高的小生境支持了更广泛的细菌功能群。这种生理过滤得到了预测表型谱的证实，该谱显示在相对高海拔的点位（如沅江，E点）需氧细菌的相对丰度明显高于低海拔点位。
除了丰富度，群落组成也存在空间变异。沅江（E）样品在PCoA中的独特聚类及其优势门从酸杆菌门向变形菌门的转变突出了其独特的细菌组合。这种对海拔趋势的偏离表明，局部因素在该点位覆盖了广泛的水文过滤。Simpson指数（反映优势度）与TK之间的显著负相关暗示了潜在联系。TK升高，可能来自外部输入，可能有利于特定、竞争性细菌类群（如某些变形菌门）的增殖，降低了均匀度——这是在人为影响土壤中观察到的模式。这强调，虽然海拔设定了广泛的模板，但局部土壤化学微调了细菌群落结构。
与细菌相反，真菌α多样性对海拔梯度没有显示出显著响应，部分支持了我们的第二个假设。真菌丰富度在各点位的相对稳定性可能归因于真菌菌丝网络和孢子对波动水分条件的恢复力，赋予它们比细菌更广的生境耐受性。相反，真菌群落丰富度主要受土壤养分有效性，特别是TP的控制，ACE和Chao指数均与TP呈强正相关。这强调了一个基本的生态位分化：虽然细菌受物理-水文条件过滤，但真菌丰富度更受关键资源（如磷）可用性的限制，磷对真菌的核酸和膜合成至关重要。
Beta多样性模式强化了细菌和真菌组装的差异驱动因子。细菌群落在PCoA空间中更大的离散度（轴的解释力更高）和显著的PERMANOVA结果反映了它们对空间和环境梯度（主要是海拔）更高的敏感性。沅江（E）的独特位置，以变形菌门主导的群落为特征，可能表明生态系统功能的局部转变。变形菌门包含许多富营养型和代谢多能的类群，能够进行反硝化和甲烷代谢。它们的优势可能是对该点位独特养分化学计量或氧化还原条件的响应，可能与该区域报告的南荻凋落物中显著更高的木质素和半纤维素含量有关，这可能改变分解途径和碳底物。
真菌群落表现出比细菌更小的空间周转，但在沅江发生了显著的组成转变，在那里子囊菌门取代担子菌门成为优势门。担子菌门在其他点位的普遍存在与其在湿地中作为主要分解者的公认作用一致。向子囊菌门优势的转变为植物性状和微生物组装之间提供了引人注目的联系。子囊菌门包含许多降解顽固聚合物的专家。这种转变可能与该区域凋落物质量的区域差异有关。值得注意的是，沅江区域的南荻凋落物据报道含有更高水平的木质素和半纤维素，这可能选择更适合降解复杂碳结构的真菌联盟。这表明了一种潜在的自下而上的控制，即植物凋落物质量影响真菌功能群组装，突出了优势植被性状与土壤真菌群落之间可能的机制联系。功能群预测为这一机制提供了直接支持，显示沅江的真菌群落绝大多数由子囊菌门内的腐生功能群（如内生-凋落物-腐生菌）主导，与一个专门分解复杂植物凋落物的群落一致。
总的来说，我们的发现证实了洞庭湖南荻群落土壤微生物组存在显著的空间异质性。这种异质性对细菌和真菌的表现不同：细菌群落空间结构更明显，似乎受与海拔和水文相关的物理梯度过滤，而真菌群落显示出更大的组成稳定性，但对资源有效性（特别是磷）和局部植物凋落物质量敏感。这为下一节更详细地剖析调节这些不同模式的特定环境因子奠定了基础。
4.2 环境因子对微生物的影响
我们的结果强有力地支持了土壤细菌和真菌群落受不同环境过滤器控制的假设。基于距离的冗余分析（db-RDA）显示，细菌和真菌群落结构与不同的环境变量集相关。值得注意的是，细菌群落结构主要与水文和土壤化学相关的非生物因子相关：ALT、pH和AHN是显著的解释变量，共同解释了27.71%的方差。在此背景下，海拔作为我们水文变化的代理指标，并得到其已知对湖泊湿地淹没模式控制的支撑。这表明，从海拔推断的水文梯度可能在过滤适应特定水分和氧化还原生态位的细菌类群中发挥着基本作用。相比之下，真菌群落结构主要依赖于土壤养分有效性：TK、TP、TN和SOM是关键驱动因子，解释了37.98%的方差。这种清晰的二分法强调了这些微生物域生态位的基本差异。
对细菌而言，ALT成为一个首要因子，整合了一系列水文介导的条件。洞庭湖的海拔梯度（25-37米）预计会创造氧化还原电位的镶嵌体，从低洼地区的频繁厌氧条件到更高海拔的更富氧条件。这种氧化还原梯度可以作为一个严格的生理过滤器，选择具有相应代谢适应性的类群，这有助于解释观察到的细菌组成的空间周转。叠加在这种水文模板上，土壤pH施加了显著影响。作为“主控土壤变量”，pH控制着酶活性和养分生物有效性，从而塑造了细菌类群的实现生态位空间。此外，AHN的重要作用突出了氮有效性的重要性，可能促进了快速生长、富营养型细菌群体的生长。这些环境过滤器的影响得到了多方面证据的证实。db-RDA结果显示细菌群落结构与海拔、pH和AHN之间存在清晰的关联。有趣的是，在OTU水平上并经过严格的FDR校正后，没有一个优势细菌OTU与测量的环境变量显示显著的线性相关。这表明细菌对这些环境梯度的响应可能更复杂、非线性或由更广泛的水文和化学模板内的微生境适应所介导。所有点位普遍预测的‘生物膜形成’和‘革兰氏阴性’表型进一步说明了细菌对波动湿地环境的常见适应策略，可能减轻了水文和化学梯度施加的压力。
相反，真菌群落结构显示出对土壤养分因子的更强依赖性。与TP和TN的显著关联强调了大量营养素在真菌生理中的关键作用。磷是核酸和膜的关键组成部分，而氮对蛋白质合成至关重要。与SOM的正相关是直观的，因为它代表了异养真菌的主要碳和能量底物。在OTU水平上，几个
