《Frontiers in Microbiology》：Effects of tree mycorrhizal dominance on soil microbial community structure and microbial nutrient limitation
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本文系统研究了丛枝菌根（AM）与外生菌根（EcM）树种及其混交林对土壤微生物群落结构和养分限制的影响。研究发现，AM纯林（Ulmus pumila）具有较高的碳获取酶活性但土壤养分含量低，微生物碳氮限制显著；EcM纯林（Pinus sylvestris var. mongolica）则表现出更高的氮磷获取酶活性和真菌多样性。混交林通过菌根策略互补，显著提升土壤有机碳（SOC）、微生物生物量碳（MBC）、氮（MBN）、磷（MBP），优化胞外酶活性，缓解微生物养分限制，并形成更复杂的微生物共现网络。结构方程模型（PLS-PM）揭示菌根主导类型和微生物生物量是缓解养分限制的关键因子。研究为干旱区退化森林恢复和混交林配置提供了理论依据。
1 引言
几乎所有的树种都与丛枝菌根（AM）真菌或外生菌根（EcM）真菌形成共生关系。这些真菌与树木交换碳（C）作为营养来源，并保护树木免受环境胁迫。与AM和EcM真菌相关的树种在凋落物质量、根和菌丝性状以及养分吸收效率方面存在差异，这强烈影响生态系统中的生物地球化学过程（C和养分循环）。一般而言，与AM相关树种相比，EcM相关树种具有较低的凋落物质量、较慢的分解速率、较高的林地C储量和较高的土壤C/N比。根据菌根关联养分经济框架，AM树种与快速养分循环的无机养分经济相关，而EcM树种与植物源性C周转缓慢、根-微生物相互作用强烈的有机养分经济相关。菌根类型的差异也与土壤微生物组成、活动和功能的显著变化一致，这些变化可以改变土壤有机碳（SOC）和养分周转。目前，大多数研究仍集中在单一主导菌根类型的生态效应上，而对AM-EcM混交林在调节土壤生物地球化学过程和微生物养分限制方面的作用的系统理解仍然缺乏。
近年来，从单一树种人工林向混交林的逐渐转变已成为加速退化森林恢复和增强生态系统服务的重要策略。研究表明，AM相关树种的凋落物可能通过添加不稳定养分和刺激微生物代谢来加速针叶凋落物的分解，从而提高土壤生态系统稳定性。Tang等人进一步证明，在针叶林中引入原生阔叶树可以促进马尾松林的生物地球化学循环并加强生态系统功能。因此，结合不同的菌根关联树种可能有助于提高资源利用效率，增强森林生态系统的稳定性。
土壤微生物通过分泌胞外酶来调节C和养分的转化与循环，从而获取能量和养分以满足其代谢需求。此外，微生物胞外酶活性的变化显著影响微生物代谢功能、养分需求和化学计量平衡。先前的研究表明，β-1,4-葡萄糖苷酶（BG）、β-1,4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）以及酸性或碱性磷酸酶（AP）分别作为微生物C、N和P需求的指标。酶化学计量将微生物养分获取策略与土壤养分有效性联系起来，反映了土壤和微生物的养分供需平衡。在过去的几十年中，酶活性和酶化学计量学，包括矢量分析，已被广泛应用于评估生态系统中的微生物代谢活动和资源限制。例如，Moorhead等人提出基于（BG/[BG + ALP]）和（BG/[BG + NAG + LAP]）计算矢量长度和角度，以量化相对C与养分获取（矢量长度）以及P与N获取（矢量角度）。树种的菌根主导类型（即由一种菌根类型主导的纯林与由AM和EcM关联树种组成的混交林）可能导致不同的土壤养分状况和微生物代谢策略，引发特定的资源获取策略。因此，探索菌根主导与微生物介导的土壤过程之间的关系对于优化林分结构、增强森林生态系统功能以及应对全球环境变化至关重要。
半干旱地区占中国国土面积的37%，在国家生态安全和生态文明建设中发挥着关键作用。本研究聚焦于科尔沁沙地南缘的典型AM关联树种（Ulmus pumila）和EcM关联树种（Pinus sylvestris var. mongolica）及其混交林。我们分析了根际土壤微生物群落结构和养分限制模式。我们提出以下假设：（1）与EcM关联树种相比，AM关联树种下的土壤表现出更强的微生物C限制和更大的细菌优势；（2）AM + EcM混交林中存在资源互补策略，可以提高林分的整体资源利用效率并减轻微生物养分限制。
2 材料与方法
2.1 研究区概况
研究区位于内蒙古赤峰市敖汉旗，地处科尔沁沙地南缘。该地区属大陆性季风气候，昼夜温差大。年平均降水量约351.8毫米，年平均气温8°C。主要土壤类型为棕壤、栗钙土和风沙土。该地区主要以人工林为主，优势树种包括樟子松、榆树和杨树。
2.2 样地选择与样品采集
我们选择了2008年在敖汉旗双井林场种植的三种林分类型：樟子松纯林（EcM关联树种）、榆树纯林（AM关联树种）以及两种树种按1:1比例种植的混交林。为确保可比性，我们在相似的立地条件（海拔、坡向、坡度）下建立样地。每种林分类型设置3个重复样地（50 m × 50 m），共9个样地，样地间距约1000米。土壤样品于2024年9月下旬采集。在每个纯林样地内选择15株标准木。在混交林中，每个样地选择15株樟子松和15株榆树作为标准木。以标准木为中心，采用抖落法在水平半径1米、垂直土层0-20厘米范围内采集根际土壤样品。随后，将同一标准样地内每5株标准木的土壤样品均匀混合，得到1个土壤样品。每个标准样地的15株相同树种标准木的土壤混合形成3个土壤样品。每个处理共获得9个土壤样品。样品过筛（2毫米）去除根系和石块后，分成三部分：一部分于4°C保存用于微生物生物量、酶活性和有效养分分析；一部分于-80°C冷冻用于微生物群落分析；一部分风干用于土壤全量养分和有机质测定。
2.3 土壤养分测定
使用台式电极pH计（Sartorius Basic pH Meter PB-10）测定土壤pH（土水比1:25，使用0.01 M CaCl2溶液）。总碳（TC）和总氮（TN）用Vario EL元素分析仪（Elementar, Germany）测定。总磷（TP）采用钼锑抗比色法测定。土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾氧化法测定，碱解氮（AN）采用碱解扩散法测定，有效磷（AP）采用Olsen法测定。
2.4 微生物生物量测定
微生物生物量碳（MBC）、氮（MBN）和磷（MBP）采用氯仿熏蒸提取法测定。熏蒸和未熏蒸样品K2SO4提取液中的C和N浓度用总有机碳分析仪（TOC-V, Shimadzu, Japan）及其TN单元（TNM-1）分析。NaHCO3提取液中的P浓度用连续流动分析仪（BRAN+LUEBBE AA3, Germany）测定。MBC、MBN和MBP的转换系数分别为kEC= 0.45, kEN= 0.54, kEP= 0.40。
2.5 土壤酶活性测定与微生物养分限制量化
我们选择了四种代表C、N和P物质循环的胞外酶：BG（C循环）、NAG和LAP（N循环）、ALP（P循环）。酶活性测定遵循Saiya-Cork等人的方法。采用矢量分析基于未转换的酶活性量化微生物代谢限制。矢量长度代表微生物碳限制，矢量长度增加表示微生物C限制增强。矢量角度低于45°表示微生物受N限制，高于45°表示受P限制。微生物N限制随矢量角度增加而减小，微生物P限制随矢量角度增加而增大。矢量长度和角度计算公式如下：
矢量长度 = √[ (ln(BG)/ln(NAG+LAP) )2+ (ln(BG)/ln(AP) )2]
矢量角度 = DEGREES{ ATAN2[ (ln(BG)/ln(AP) ), (ln(BG)/ln(NAG+LAP) ) ] }
2.6 微生物群落组成测定
使用HiPure Soil DNA kits从土壤样品中提取微生物群落基因组DNA。使用带Barcode的特异性引物扩增ITS的ITS2区和16S rDNA的V3+V4区。引物序列为：ITS3_KYO2: GATGAAGAACGYAGYRAA; ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC 和 341F: CCTACGGGNGGCWGCAG; 806R: GGACTACHVGGGTATCTAAT。扩增产物连接测序接头，构建测序文库，在Illumina平台上进行测序。使用UPARSE方法以97%相似度聚类操作分类单元（OTUs），并识别和去除嵌合序列。获得的OTUs使用MaarjAM数据库进行比对，未分类的OTUs在NCBI数据库中手动检查和过滤。真菌ITS数据的测序深度为每样本67,329至78,875条有效序列，平均73,428条；细菌16S数据的测序深度为每样本114,221至130,978条有效序列，平均121,412条。为消除测序深度差异对α多样性分析的影响，分别对ITS和16S数据集进行稀疏化处理至能保留各数据集中所有样本的最小测序深度。使用稀疏化后的OTU表计算Observed richness、Chao1、Shannon-Wiener和Simpson指数。
2.7 统计分析
使用DPS（版本9.01）进行数据分析，使用Origin（版本9.4）进行数据可视化。采用单因素方差分析（ANOVA）和Fisher最小显著差异法（LSD）检验在5%显著性水平上评估根际土壤理化性质、胞外酶活性、微生物生物量以及真菌和细菌多样性。使用Origin（版本9.4）进行土壤胞外酶活性的主成分分析（PCA）。在R（版本4.2.1）中过滤掉平均相对丰度<0.01%且在总样本中出现少于50%的OTUs。使用"Hmisc"包计算OTUs间的Spearman等级相关，仅保留强（|r| > 0.9）且显著（p < 0.05）的关联用于构建共现网络。然后使用"igraph"和"ggClusterNet"包构建无向加权微生物共现网络，并计算网络拓扑属性（包括节点数、边数、平均度、平均路径长度、聚类系数和模块性）。使用Gephi v0.9.2进行网络可视化。使用R（版本4.2.1）中的"mgcv"包拟合广义相加模型（GAMs）以检验微生物C和N限制与土壤pH、土壤养分和微生物生物量之间的关系。使用R（版本4.2.1）中的"plspm"包进行偏最小二乘路径建模（PLS-PM），以评估影响微生物资源限制的路径，包括菌根主导类型（即樟子松纯林、榆树纯林和混交林中两种树种的根际土壤）、pH、土壤养分（即TC、TN、TP、SOC、AN、AP）、真菌多样性（即真菌Observed richness和Chao1指数）、细菌多样性（即细菌Observed richness和Chao1指数）和微生物生物量（即MBC、MBN、MBP）。为确保模型稳健性，排除了载荷值低于0.6的变量，包括真菌Shannon-Wiener指数、真菌Simpson指数、细菌Shannon-Wiener指数和细菌Simpson指数。
3 结果
3.1 树木菌根主导对土壤化学性质的影响
树木菌根主导对根际土壤化学性质有显著影响（p < 0.05）。TC、TN、TP、SOC、AN和AP均在榆树纯林（Up.P）达到最低值，表明与其他处理存在显著差异（p < 0.05）。相比之下，混交林中的榆树根际土壤（Up.M）表现出最高的TC（9.85 g kg-1）、TN（0.58 g kg-1）、SOC（4.05 g kg-1）和AN（114.91 mg g-1），表明混交林显著增加了AM相关根际土壤的有机碳输入和氮积累水平，从而促进了土壤肥力。AP在樟子松纯林（Ps.P）达到最高值（2.73 mg g-1），各处理间存在显著差异（p < 0.05），表明外生菌根树种根际土壤在获取和维持P方面具有一定优势。混交林通过AM和EcM树种的组合有效改善了根际土壤的碳氮养分状况，并对土壤pH产生一定的调节作用，有利于土壤养分有效性和微生物功能。
3.2 树木菌根主导对土壤胞外酶活性及微生物资源限制的影响
C获取酶（BG）活性在榆树纯林（Up.P）最高（29.60 μmol h-1），分别是混交林中樟子松（Ps.M）和榆树（Up.M）的1.94和1.92倍（p < 0.05）。N获取酶（NAG+LAP）活性在樟子松纯林（Ps.P）最高（71.49 μmol h-1）（p < 0.05）。P获取酶（ALP）活性在混交林中的樟子松（Ps.M）和榆树（Up.M）根际土壤中升高，分别为43.37和43.57 μmol h-1（p < 0.05）。AM和EcM混交林通过互补的C需求提高了C资源利用效率，但也加剧了微生物对P的竞争。胞外酶活性的主成分分析显示，榆树纯林（Up.P）的微生物C限制最高。数据点的分布进一步表明，与樟子松纯林（Ps.P）相比，榆树纯林（Up.P）受到更强的微生物C和N限制，而在AM-EcM混交林中微生物资源限制得到缓解。根据胞外酶活性的相对比例计算的矢量长度和角度量化了微生物C和N限制。所有处理的矢量角度均低于45°，表明微生物主要受N限制而非P限制。与榆树纯林（Up.P）相比，混交林中榆树根际土壤（Up.M）的矢量长度从1.34降至0.98，矢量角度从39.66°升至42.02°；与樟子松纯林（Ps.P）相比，混交林中樟子松根际土壤（Ps.M）的矢量长度从1.08降至0.97，矢量角度从40.00°升至42.91°，矢量角度向45°移动。与纯林相比，混交林的矢量角度向45°移动，同时矢量长度减小。这种模式表明微生物N限制得到缓解，N:P供需平衡更加均衡，微生物C限制也减弱
