《New Phytologist》：Variation in herbivore defense strategies among plant species differing in elevational distribution and the role of temperature in defense
引言
物种的空间分布受到多种生态因素的影响，其中气候是最重要的因素之一。气候可以解释许多物种当前的纬度和海拔分布，并导致这些地理尺度上群落的更替。与此同时，植物与其食草动物之间的相互作用也沿着纬度和海拔梯度发生变化。然而，气候不仅影响哪些植物和食草动物在空间上共存，还可以影响植物-食草动物相互作用的其他方面，例如改变植物生长或植物防御。因此，预测植物-食草动物相互作用的地理分布需要了解介导这些相互作用的植物性状如何通过进化响应和即时响应来响应气候变化。
大多数陆地食草动物（无论是丰度还是多样性）都是昆虫。作为变温动物，它们的生理、发育和终生表现与温度密切相关。因此，预计植物-昆虫食草动物的相互作用在较冷的气候条件下、向两极或高海拔地区的重要性会降低。尽管一些研究发现高纬度和高海拔地区食草动物的密度和物种丰富度有所下降，但其他研究在同一研究区域或沿着不同的海拔梯度报告了相互矛盾的发现。这些结果突显了影响这些梯度上植物-昆虫食草动物相互作用丰度的其他因素，例如植物防御部署的差异。
为了防御食草动物，植物进化出了多种策略。这些策略的范围从使它们能够补偿组织损失的机制，到阻止食草动物定居、取食和繁殖或降低适口性的性状。然而，防御会带来成本，因为它通常涉及将资源从生长和繁殖转移开，导致生长-防御的权衡。因此，防御性状通常不是组成型表达，而是可塑性（即诱导型）地响应食草动物。诱导防御可能对资源的需求较低，并且当成本仅在激活时产生且攻击罕见时更受青睐；然而，如果延迟响应未能防止严重损害，则可能具有风险。组成型和诱导型防御预计在物种内和物种间以及沿生态/气候梯度上呈拮抗性共变。例如，沿海拔梯度，组成型防御预计在食草动物压力强大且持续的低海拔地区更高，而诱导防御应在食草动物稀疏的高海拔地区更高。
除了组成型和诱导型防御的区别之外，大量研究报告了高海拔地区防御水平的增加。高海拔植物的更高防御可能是适应以避免组织损失，在生长季节较短的高海拔生境中，组织损失可能更难补偿。或者，改进的防御可能是适应高海拔气候条件的副产品，间接增加了植物对食草动物的抗性。生活在高山环境中的植物通常比低海拔的植物具有更高的叶片干物质含量和更厚的叶子。这些性状有利于叶片的坚固性和长寿性，并且叶片结构的这种差异也可能影响植物-食草动物的相互作用。
除了进化的功能性状模式外，植物生命周期内的温度波动也会影响其防御策略。在高温下，植物可能会以可塑性方式增强防御，例如通过上调特化代谢组来阻止食草动物。然而，次生代谢物产量的增加并不局限于较温暖的温度。在低温下生长的甘蓝和拟南芥中也观察到了硫代葡萄糖苷水平增加的趋势。尽管如此，其他研究表明，在寒冷环境中栽培的植物物种表现出降低的组成型防御。这些发现强调了温度与植物防御之间的复杂关系，增加了理解驱动植物-食草动物相互作用沿纬度和海拔梯度动态机制的难度。
本研究旨在研究具有不同海拔分布（进化差异）的物种在组成型和诱导型防御方面的差异，以及防御中对温度的可塑性响应（即时差异）。我们选择了30种在中欧具有低到高海拔分布的十字花科物种，并在一个海拔从600到2000米的山坡上的五个地点进行了移植实验。我们估计了食草动物的多样性和丰度，以及植物的受损情况。在一项涉及三种温度 regime（寒冷、适宜和温暖）和12个物种子集的气候箱实验中，我们评估了叶片结构性状和硫代葡萄糖苷产生的组成型和诱导型防御。
材料与方法
植物物种与取样
十字花科包含约310属，3500种，分布在世界各地。该科的特征是产生称为硫代葡萄糖苷的特定次生代谢物，它们是阴性的硫代葡萄糖苷。这些代谢物在被黑芥子酶激活时对昆虫食草动物起到威慑作用。对于移植实验，我们选择并收集了十字花科30个物种的种子，这些物种具有相似的土壤需求（湿度指示值在2到4之间），并代表了欧洲阿尔卑斯山脉的低海拔和高海拔类群。对于气候箱实验，我们从原来的30个物种中根据以下标准选择了12个物种：（1）低海拔和高海拔物种的代表性均等；（2）良好地代表了系统发育。
野外移植实验
地点：从2018年秋季到2019年夏季，我们在瑞士阿尔卑斯山（Calanda山）进行了一项移植花园实验。沿着一条超过3公里长的海拔梯度，我们选择了五个地点，海拔高度分别为601、997、1395、1610和1998米。这些地点位于一个由钙质基岩组成的东向山坡上。气候梯度是连续的，年平均温度（地面以上5厘米）从最低地点的10.20°C到最高地点的4.08°C。
移植：移植从最高点开始，到最低点结束，历时2个月。在每个地点移植是在长期日平均温度降至约10°C时进行的。移植前，种子在气候室中播种，幼苗保存约1个月。在每个地点，600株植物分布在两个空间区块中，排列成多孔托盘平行行。托盘被埋入土壤直至其边缘。为了保护移植地点免受大型食草动物侵害，安装了1米高的围栏。为了标准化土壤条件并确保各地点变化的主要因素是气候和昆虫食草动物压力，我们在所有移植地点使用了填充相同基质的盆。
在每个地点，我们使用每地点四个气候记录仪随机放置在空盆上方，并分布在两个区块中，记录地上温度（地面以上5厘米；‘微气候温度’），每15分钟一次。
气候箱实验
实验设计：12个物种在实验条件下生长，涉及操纵的温度 regimes（寒冷、适宜和温暖）和防御诱导（使用或不使用茉莉酸甲酯），采用完全因子设计。后者用于模拟植物对咀嚼式食草动物的响应。MeJA是一种具有多种功能的植物激素；其中之一是激活植物防御以响应昆虫造成的创伤。下游效应是产生对昆虫食草动物有毒的蛋白质。实验应用MeJA诱导防御优于创伤，因为可以实现更特异的响应。我们随机选择每个种群和物种的两个种子家系，并将每个家系的种子播种在六个盆中，每个处理组合一个盆。播种和早期植物培育与移植研究相似，只有一些微小差异。
处理：一旦植物长到两叶期，它们被随机分配到六个生长箱中六个处理组合中的一个，以防止食草动物诱导的挥发性化合物的交叉污染。温度处理如下：寒冷（恒温14°C）、适宜（恒温20°C）和温暖（恒温27°C）。这些温度涵盖了从丘陵带到高山带夏季白天可能经历的范围。光照和相对湿度在六个生长箱中保持恒定。然后，一半生长箱中的植物接受外源MeJA处理。单个植物的开放叶片每周处理一次，持续6周。另一半植物作为对照，接受相同的处理，但MeJA被等体积的去离子水替代。我们每周在每个生长箱中随机化盆的位置。一旦植物开始减慢生长，就停止处理，并收集叶片样本进行表型分析和化学分析。
性状评估
移植实验中的食草动物丰度：为了评估沿海拔梯度的食草动物丰度，我们使用了扫网采样和陷阱法。在2019年春季/夏季，我们在每个地点进行了两次扫网采样，并在每个地点安装了五个陷阱，每周检查一次，持续4周。我们将昆虫鉴定到目级，并仅保留文献中描述为植食性的昆虫用于分析。
移植实验中的食草动物损害：在2018年秋季和2019年春季，我们每周评估移植植物上的叶片食草动物损害，持续8周。我们将秋季定义为从移植到日平均温度连续6天变为≤0°C的时期。春季开始于日平均温度连续6天>0°C时。一旦春季开始，我们等待5-6周，让植物在冬季后恢复并让昆虫出现。我们对食草损害进行评分，等级从0到5。由于整个季节每周测量的损害水平与最终损害水平高度相关，我们使用季末损害水平进行进一步分析。
气候箱实验中的植物生长：我们通过测量最初两周每周两次，随后七周每周一次的两个最长叶片的长度来估计植物生长。长度数据用于拟合七个生长模型。平均而言，3参数逻辑斯蒂模型产生了最佳拟合。我们从该模型中提取了以下参数：达到半渐近大小的时间、最大生长率和渐近大小。
气候箱实验中的植物物理防御：当植物即将达到其渐近大小时，我们从每株植物上取样两片相同发育阶段的叶子。我们使用比叶面积（SLA）和叶片干物质含量（LDMC）作为结构防御和可消化性的代理指标。较低的SLA和较高的LDMC表明增加的结构防御和降低的可消化性。尽管这两个变量往往呈负相关，但两者通常都包含在针对食草性的结构防御研究中。收获后，我们立即用分析天平测量每片叶子的鲜重，扫描叶子，并用ImageJ软件估算其表面积。每片叶子的干重是在60°C下放置48小时后测量的。
气候箱实验中的植物化学防御：为了测量硫代葡萄糖苷含量，我们每株植物取样约50毫克新鲜叶片组织。组织在液氮中快速冷冻，储存在-80°C，然后冷冻干燥48小时。叶片硫代葡萄糖苷分析在纳沙泰尔分析化学平台进行。每个样品5毫克干物质用组织研磨仪研磨成粉末，加入溶解在含甲酸的水中的冰甲醇。样品涡旋，在组织研磨仪中振荡，然后离心，上清液用提取溶液稀释20倍。样品通过超高效液相色谱-高分辨率质谱进行分析。我们鉴定了57种不同的候选硫代葡萄糖苷化合物。吲哚硫代葡萄糖苷以葡萄糖芸苔素当量定量，而其他则以葡萄糖萝卜硫素当量定量。
总硫代葡萄糖苷产量是所有检测到的化合物浓度的总和。通过 summing 这三个类别中化合物的浓度来计算脂肪族、芳香族和吲哚硫代葡萄糖苷的总浓度。此外，我们计算了三个植物化学多样性指数：一个强调丰富度——化合物数量；一个强调均匀度——辛普森多样性指数；一个强调功能方面——Rao二次熵。对于后一个指数，我们考虑了每个硫代葡萄糖苷的化学类别、分解类别和分子量作为功能性状。
统计分析
所有分析和图表均使用R 4.3.2进行。统计分析基于贝叶斯广义线性混合模型。后验报告为中值，显著性基于90%最高密度区间的可信区间和方向概率进行评估。值从四个独立的并行链中抽取。调整了老化、迭代次数、细化间隔、最大树深度和自适应增量，以确保有效样本量至少为1000。通过视觉检查诊断图和Rhat值来检查模型收敛性。在分析之前，对物种在瑞士出现的中位海拔进行对数转换，连续解释变量进行均值中心化。在适用的情况下，将物种间的亲缘关系作为随机效应纳入。使用‘geiger’包的‘treedata’函数修剪系统发育。使用‘ape’包中的‘vcv’函数生成亲缘关系矩阵，并通过brm的‘cov_ranef’参数调用。对于所有分析，我们通过使用留一法交叉验证准则比较包含和不包含系统发育的模型拟合来评估系统发育的贡献。
结果
野外移植实验
海拔梯度上的食草动物丰度：两种采样方法产生了显著不同的食草动物数量，陷阱法中数量更高。采样到的大多数昆虫来自鞘翅目，其次是半翅目、直翅目、鳞翅目和缨翅目，以及未鉴定的鞘翅目和/或鳞翅目幼虫。另一组食草动物是陆地蜗牛。结合两种采样方法的计数，我们发现食草动物丰度在最低地点最高，在第二高地点最低。然而，在整体模型中，与海拔的关联不显著。但我们发现海拔和采样方法之间存在显著的交互作用，扫网采样捕获的昆虫数量随着海拔升高而下降，但陷阱法则没有。当用移植地点的年平均温度代替海拔时，采样方法的影响仍然存在，但交互作用不显著。总体而言，有迹象表明某些食草动物的丰度在较高海拔有所减少。
海拔梯度上的食草动物损害：尽管有食草动物丰度随海拔变化的迹象，但第一个秋季和次年春季的食草动物损害并未随着移植地点的海拔而发生显著变化，地点海拔与物种出现中位海拔之间的交互作用也不显著。此外，春季的食草动物损害与扫网和陷阱法估算的两种食草动物丰度没有显著关联。然而，在这个第二种模型中，扫网食草动物丰度与物种出现海拔之间的交互作用是显著的，结果难以解释，因为随着昆虫数量的增加，观察到的损害更少。最后，当在第三类模型中使用年平均温度代替移植地点海拔时，MAT及其与物种出现海拔的交互作用均不显著。食草动物损害在较高海拔或较冷气候下并未降低。然而，在春季调查中，与低海拔植物相比，高海拔植物遭受的食草动物损害更少。这一结果被所有三种类型的模型所揭示。在秋季也有一个可比拟但不显著的趋势。
气候箱实验
防御与植物生长：在适宜温度下，低海拔和高海拔物种在组成型防御上没有差异。唯一随物种出现中位海拔而变化的性状是最大生长率和渐近大小。高海拔物种生长显著更慢，体型也更小。在适宜温度下和跨物种的相关性分析仅揭示了生长和防御性状之间的三个显著关联：较高的LDMC值与较短的时间到半大小、较高的最大生长率和较高的渐近大小相关。结果表明，在海拔梯度上，物种间在组成型防御上没有进化差异，并且在对照植物中没有检测到生长与防御之间的权衡。
模拟食草动物攻击的MeJA处理导致诱导的SLA降低，以及总硫代葡萄糖苷、芳香族硫代葡萄糖苷和吲哚硫代葡萄糖苷检测不到的植物比例减少。此外，MeJA处理与更短的时间到半大小、更低的最大生长率和更小的渐近大小相关。相关性分析再次未发现在适宜温度下诱导植物中存在生长与防御权衡的显著证据。唯一显著的相关性是硫代葡萄糖苷的辛普森多样性与最大生长率之间，并且是正相关的。
几个MeJA处理与物种出现海拔之间的交互作用是显著的。在MeJA处理下与未处理相比，高海拔物种增加了LDMC，降低了SLA，并且具有更高的硫代葡萄糖苷辛普森多样性。此外，它们的时间到半大小变得更短，渐近大小更小。一般来说，高海拔物种比低海拔物种表现出更强的诱导响应。
对温度变化的响应：低于和高于适宜温度且无MeJA诱导会影响叶片结构和化学防御性状，表明组成型防御随温度变化。冷和热处理影响叶片韧性，导致LDMC降低，并且在温暖条件下SLA更高。此外，在寒冷条件下，总硫代葡萄糖苷和脂肪族硫代葡萄糖苷的浓度较低，而芳香族和吲哚硫代葡萄糖苷更常检测不到。相应地，三个硫代葡萄糖苷多样性指数显著降低。相反，温暖条件导致总硫代葡萄糖苷浓度增加，所有三个化学家族的硫代葡萄糖苷以及硫代葡萄糖苷丰富度均显著增加。最后，在寒冷条件下，植物生长速率较低，体型较小，而在温暖条件下，未检测到生长的显著变化。结果表明，相对于适宜温度，在较冷和较暖温度下，叶片形态的组成型防御降低，而组成型化学防御对温度的响应则不同，温度变冷时降低，变暖时增加。
外源MeJA应用影响了温度响应。与适宜温度和应用MeJA相比，在较冷和较暖条件下，LDMC增加，并且仅在寒冷条件下SLA降低，表明诱导的物理防御增强。化学防御的变化很小。在寒冷条件下，具有可检测硫代葡萄糖苷水平的植物较少，并且在温暖条件下，具有可检测吲哚硫代葡萄糖苷的植物较少。然后，在寒冷和温暖条件结合MeJA应用下，时间到半大小更早。总之，对诱导防御的温度响应主要影响叶片结构性状。
讨论
我们的研究探讨了温度如何在进化时间和生态时间尺度上塑造植物对食草动物的防御。作为植物物种进化所沿的温度梯度的代理，我们使用了海拔和具有不同海拔分布的植物物种。首先，我们调查了食草动物丰度是否沿着局地海拔梯度减少，并在扫网样本中发现了一些证据。其次，在一项室外移植实验中，我们检查了低海拔和高海拔物种在易受食草性方面的差异，并发现高海拔植物通常遭受较低水平的食草性。第三，一项气候箱实验表明，高海拔物种更具食草动物抗性，因为它们在模拟食草动物攻击的MeJA应用下，启动了更强的诱导防御。最后，气候箱实验表明，与适宜温度相比，在寒冷和温暖条件下，组成型防御以及较小程度的诱导防御存在强烈差异。这些发现在更广泛的框架内进行了讨论，包括植物物种对凉爽与温暖气候下食草性的进化适应以及温度依赖的可塑性调整。
在一项山区斜坡的有限调查中，我们检查了可能的植食性昆虫的丰度是否随海拔升高而下降。扫网采样在较高海拔比低海拔获得了更少的潜在食草动物，支持了变温动物在较冷气候下变得不那么活跃和丰富的观点，那里较低的温度减缓了它们的代谢、生长、发育和繁殖。扫网主要收集了半翅目昆虫，其丰度随海拔升高而下降，正如先前所证明的。鞘翅目昆虫丰度较低，但在扫网中表现出类似的模式。然而，这些食草动物丰度随海拔下降的趋势在陷阱法中没有观察到，可能是因为两种方法捕获不同的昆虫类群。实际上，陷阱法主要由鞘翅目昆虫主导，它们似乎没有随海拔升高而减少丰度——至少在这些陷阱中是这样，正如在瑞士东部阿尔卑斯山先前观察到的那样。尽管这项调查范围有限，但扫网结果总体上与先前显示食草动物丰度随海拔升高而下降的研究一致。然而，这种模式在我们的研究中并未转化为较高海拔处更低的损害水平。我们未检测到跨移植地点的食草性随海拔下降的趋势。
鉴于高海拔地区食草动物丰度通常较低，人们可能预期高海拔植物物种在面对食草性时防御较差，但事实并非如此。相反，我们对30种十字花科物种的野外实验显示，当暴露于相同环境条件时，高海拔物种在春季和夏初遭受的食草动物损害低于低海拔物种。这些结果与先前对十字花科的研究一致，该研究表明，来源于高山地区的山芥属和16种碎米荠属物种比其低海拔对应物种受食草动物影响更小。气候箱实验为了解高海拔物种如何实现这种更好的保护提供了见解。在无食草动物诱导的情况下，高海拔物种在叶片物理和化学防御性状上与低海拔物种没有差异，表明组成型防御没有差异。然而，在模拟食草动物攻击的MeJA处理下，高海拔物种比低海拔物种更多地增加了其叶片干物质含量，表明它们可能由于更坚固的叶子而获得了一些抗性。然而，随着叶片干物质含量的增加，高海拔物种达到了约与低海拔物种相同的表达水平，因此，这种变化不能完全解释它们在野外看到的更好保护。
最可能增加高海拔物种保护性的诱导性状是硫代葡萄糖苷的表达。虽然总硫代葡萄糖苷量和化合物丰富度在海拔梯度上没有显著差异，但高海拔物种在化合物均匀度上表现出更大的提高，表明是分配策略的转变而非整体数量的增加。高海拔物种植物化学均匀度的这种增加可能反映了其诱导防御策略的一个关键组成部分。通过更平衡的化学化合物表达，植物可以增强产生针对更广泛食草动物的有效化合物（浓度足够）的可能性。尽管高海拔地区可能无法维持比低海拔地区更广泛的食草动物，但这种高山物种更大的化学防御潜力可能会增强其整体防御效果。实际上，增加植物化学多样性和均匀度可能是一种更有效和成本效益更高的对抗昆虫食草动物的策略，因为化合物可以同时作用于食草动物生理的多个方面。
结果更支持植物防御进化领域的一些长期假设，而对其他假设的支持较少。例如，我们发现高海拔物种并未表现出更高的组成型防御，这为资源可用性假说提供了不支持。该假说围绕组织替换的成本，并认为在恶劣（和营养贫乏）条件下，植物应投资于组成型防御。在高海拔地区，一个特别恶劣的环境方面是短暂的生长季节，组织替换必须是一个挑战。我们的发现更符合支持诱导防御的假说，当食草性发生不规律或维持高水平的组成型防御带来相当大成本时，预计这种策略是有利的。食草动物压力在高山地区可能确实更罕见。
一般的分配假说似乎也具有相关性。在食草动物诱导下植物体型变小，特别是在高海拔物种中，这与预测的资源从生长向防御转移的转变一致。尽管我们在处理内几乎没有发现生长和防御性状之间相关性的证据，但这并不排除权衡的重要性。此外，高海拔物种响应食草动物诱导的较早生长可能部分是一种逃避策略，这伴随着其自身的权衡——体型变小。先前在十字花科中的宏观进化工作表明，在高温下，生长速度和体型涉及权衡。即，在每日高温时段下，高海拔物种表现出更早和更快的生长，但它们的渐近大小更小。茉莉酸是与植物防御相关的关键信号分子，但它也在植物对各种非生物胁迫的恢复力中扮演重要角色。因此，观察到的响应茉莉酸盐处理的重新分配模式可能涉及逃避，甚至可能是对短暂生长季节适应的副产品，尽管需要进一步研究来证实这一点。
沿海拔梯度，温度是影响植物表型并影响植物-食草动物相互作用的非生物环境的一个关键方面。我们的研究表明，仅温度就会影响组成型防御。我们发现，在寒冷条件下，叶片结构防御、硫代葡萄糖苷的浓度和多样性都较低。在温暖条件下，植物仍然产生更弱和更薄的叶子，但硫代葡萄糖苷的浓度和多样性增加了。额外的食草动物诱导导致在寒冷和温暖条件下物理防御增加，并且它减少了在寒冷条件下具有可检测化学防御的植物比例。对植物化学浓度和多样性的影响可能在一定程度上反映了温度对硫代葡萄糖苷生物合成途径各个方面的影响，包括基因表达和酶活性。然而，化学防御的增加也可能是应对温暖条件下变温食草动物活动增强的进化响应，考虑到结构防御的减少。
即时温度响应也可以与进化的物种差异进行比较，以深入了解共梯度或反梯度适应的表达。如果可塑性变化与沿温度梯度的进化差异一致，这表明适应性进化朝着增强可塑性效应的方向发展。相反，如果可塑性和进化变化的模式相反，则可能表明适应不良的可塑性被适应性进化所抵消。由于组成型防御在低海拔和高海拔物种之间没有差异，因此在该水平上没有共梯度或反梯度变异的证据。然而，高海拔物种诱导的更强叶片结构和更高化学多样性，以及在寒冷条件下叶片结构和化学多样性表达的降低，反映了反梯度变异。
总体而言，我们的研究表明，诱导防御食草动物是高海拔十字花科物种的主要保护形式。低海拔物种防御较差，但可能具有更高的耐受性和更多攻击后的恢复时间。我们的研究还强调了植物化学多样性和均匀度作为植物防御机制的重要性，这在高海拔地区普遍性增加。此外，虽然气候变化导致的变暖条件将增加食草动物的丰度和活动，从而增加对植物的食草压力，但我们证明所研究的物种，包括高海拔十字花科，可以在可能更多食草动物的温暖条件下表现良好。最后，虽然茉莉酸途径主要因其在防御食草性中的作用而被研究，但我们的结果表明其在介导生物和非生物胁迫响应之间串扰的核心作用，特别是在高海拔植物中。我们主张未来的研究探索食草性和非生物因素之间的相互作用，以完全揭示驱动防御策略进化的机制。
