橡胶衍生污染物6PPD及其衍生物6PPD-Q在斑马鱼中的糖脂代谢毒性比较及其作用机制

《Journal of Environmental Sciences》：Comparative glycolipid metabolic toxicities and mechanisms of the rubber-derived contaminants 6PPD and its derivative 6PPD-Q in zebrafish

本研究系统比较了6PPD及其氧化产物6PPD-Q对斑马鱼胚胎及幼鱼发育的毒性机制。结果显示，在环境相关浓度（10 μg/L）和亚致死剂量下，两者均诱导剂量依赖性畸形，但6PPD-Q半数致死浓度更低（165.2 μg/L vs 991.6 μg/L），毒性更强。RNA-seq和生物信息学分析表明，两种污染物均通过破坏甘油磷脂代谢和胰岛素信号通路引发葡萄糖-脂质稳态失衡，同时抑制三羧酸循环。脂质堆积和能量代谢障碍在6PPD-Q组更为显著，揭示了其不同的分子作用途径（如PLA2、PLD1和LPCATs通路），为环境健康风险评估提供新依据。

　　

作者：常润峰、向海鸥、严金、王泽军、钱秋辉、王学东、王慧丽、吴佳

中国苏州科技大学环境科学与工程学院，苏州215009

摘要

新兴污染物6PPD及其氧化产物6PPD-Q通过橡胶制品的磨损进入环境，但目前关于其毒性的毒理学数据非常有限，难以进行风险评估。本研究在环境相关浓度和亚致死剂量下，比较了这两种物质对斑马鱼糖脂代谢的毒性及其作用机制。结果表明，这两种物质均能诱导发育畸形，其中6PPD在120小时时的半数致死浓度（LC₅₀）为991.6 μg/L，6PPD-Q为165.2 μg/L，显示出6PPD-Q具有更强的致畸性和致死性。RNA测序和生物信息学分析显示，这两种物质在醚脂质、甘油磷脂、甘油脂质代谢及胰岛素信号通路中诱导了差异表达基因（DEGs），表明它们共同扰乱了葡萄糖-脂质的稳态。油红O（ORO）染色和实验结果表明，这两种物质会导致肝脏脂质积累（总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高，同时降低高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），并引发葡萄糖代谢紊乱（高血糖、胰岛素水平下降、乳酸积累等），提示可能存在胰岛素抵抗和三羧酸循环（TCA）受阻。能量代谢也受到抑制（ATP水平降低，线粒体膜电位ΔΨm下降），尤其是6PPD-Q组的影响更为严重。PPI网络分析和RT-qPCR实验表明，6PPD通过磷脂酶A2（PLA2）介导的途径干扰糖脂代谢，而6PPD-Q则通过PLA2、磷脂酶D1（PLD1）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶（LPCATs）发挥作用。本研究证实了这两种物质通过不同机制诱导糖脂代谢紊乱，为环境健康风险评估及相关策略提供了依据。

引言

随着橡胶制品的过度使用，人们对其环境残留物和潜在毒性越来越关注，包括其上游的抗氧化剂和下游的衍生物。N-(1,3-二甲基丁基)-N-苯基-p-苯二胺（6PPD）是最广泛使用的合成抗氧化剂之一，被广泛应用于制造轮胎、皮带、软管、电缆和鞋底等产品（Datta等人，2007年）。在橡胶老化过程中，摩擦和磨损会释放含有6PPD的颗粒到环境中。这些颗粒可能被大气颗粒物（如PM2.5）吸附，或通过雨水径流和地表径流进入水生系统，最终沉积在土壤和水中。由于6PPD本身的不稳定性，在释放过程中容易氧化成更稳定的醌类衍生物6PPD-Q。

作为新兴污染物，6PPD和6PPD-Q在多种环境介质（如水、空气、灰尘和土壤）中均被频繁监测到，是PM2.5中的高风险成分（Kole等人，2017年）。较大的轮胎磨损颗粒主要沉积在道路表面或附近区域，因此其浓度较高。黄等人报告称，中国广州道路灰尘中6PPD的浓度范围为4.1至238 ng/g，6PPD-Q的浓度范围为3.0至88.1 ng/g。进一步分析发现，地下停车场灰尘中的PPD总量最高，其次是道路灰尘和室内灰尘（最低）。香港灰尘样本中6PPD的浓度范围为31.4至831 ng/g，6PPD-Q的浓度范围为9.50至936 ng/g（Huang等人，2021年）。另一项研究表明，东京道路灰尘中6PPD和6PPD-Q的浓度分别为45-1175 ng/g和116-1238 ng/g，其中主干道的6PPD-Q浓度更高（Hiki和Yamamoto，2022年）。道路灰尘和悬浮颗粒中的PPD和6PPD容易通过城市径流进入水环境，对水质安全造成严重影响（Sieber等人，2020年）。

6PPD和6PPD-Q也在实际水生环境中被检测到。Monaghan等人的研究表明，雨水中6PPD-Q的浓度范围为50至5,500 ng/L，显著高于河水中85-110 ng/L的浓度。值得注意的是，6PPD-Q在地下水中的浓度为0.7–2.8 ng/L，在城市河流沉积物中的浓度高达46.6 ng/g，显示出较强的环境迁移性和积累潜力；某些地区的道路径流和融雪中的浓度甚至超过了鲑鱼的急性毒性阈值（Wang等人，2025年）。Rauert等人发现，降雨期间地表水中的6PPD-Q最高浓度可达88 ng/L（Rauert等人，2022年）。旧金山湾区城市径流中6PPD的浓度范围为0.8至19 μg/L，6PPD-Q的浓度为4.1–6.1 μg/L（Tian等人，2022年）。最新研究表明，轮胎洗液中的6PPD浓度范围为10至100 μg/L，橡胶工业废水处理厂进水口的最高浓度为0.24 mg/L（Chen等人，2024年）。美国环保署（EPA）于2024年提出了6PPD的急性水生生物筛选值为8.9 μg/L（Jarvis等人，2025年）。这一浓度接近环境样本中的较高水平，反映了受污染水环境中的最坏情况。因此选择该浓度来评估6PPD和6PPD-Q对斑马鱼的影响，以反映它们在现实暴露条件下的潜在危害。6PPD和6PPD均具有环境持久性，其中6PPD的半衰期更长，长期影响可能对水生生物和人类健康构成威胁。

作为两种新的污染物，关于它们的毒性研究受到了广泛关注。大量研究记录了6PPD和6PPD-Q的水生毒性。在μg/L浓度下，6PPD是导致银鲑鱼大量死亡的主要原因（Tian等人，2021年）。糖脂代谢对维持水生生物的正常生理功能至关重要，一旦代谢紊乱，将引发胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病、脂肪肝和肝癌等一系列代谢疾病。现有研究表明，6PPD/6PPD暴露与脊椎动物的脂质代谢紊乱有关。例如，两栖动物Pelophylax nigromaculatus在暴露于1–10 μg/L浓度的6PPD/6PPD后，表现出肝脏脂质积累和脂解相关基因表达下调（Liu等人，2024年）。相比之下，鱼类在暴露后表现出PPARγ信号通路显著下调，同时促炎因子（TNF-α和IL-6）上调，但未观察到明显的肝脏脂质积累现象（Jiao等人，2025年）。目前尚未有研究报道6PPD/6PPD暴露与脊椎动物胰岛素通路紊乱的关联，现有研究仅记录了氧化应激和神经毒性等效应。因此，全面研究6PPD和6PPD对活体糖脂代谢的差异毒性及其作用机制至关重要，有助于全面评估它们的环境和健康风险。这些数据和发现有助于预防、诊断和治疗由污染引起的代谢紊乱综合征，并为管理和控制这两种污染物提供理论和实践指导。

伦理声明

温州医科大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了我们的研究计划，允许我们伦理地使用斑马鱼（Danio rerio）。所有实验均严格遵循IACUC指南进行，所有斑马鱼手术均在冰面上进行以减少痛苦。

实验动物和生化试剂

野生型AB品系斑马鱼（Danio rerio）由中国斑马鱼资源中心（武汉）提供，成年鱼饲养在Hisheng（上海）的斑马鱼饲养/培养系统中。

6PPD和6PPD-Q对斑马鱼早期发育的影响

系统研究了6PPD和6PPD-Q对斑马鱼胚胎发育的致畸作用，并使用Ecosar Application软件分析了三种水生生物在不同发育阶段的半致死浓度。如附录A表S3所示，6PPD在96小时鱼、绿藻和48小时水蚤中的LC₅₀/EC₅₀值分别为864、1300和628 μg/L，显著高于6PPD-Q的288、226和432 μg/L。

讨论

作为新兴污染物，6PPD和6PPD-Q具有普遍分布和持久性的特点，会通过光氧化、生物累积和生物放大作用在食物链中逐渐富集（Baensch-Baltruschat等人，2020年）。然而，它们通过食物主动摄入或环境被动摄入对人体的潜在健康影响长期以来被忽视。研究人员经常在各种环境中检测到6PPD和6PPD-Q的存在。

结论

本研究系统比较了新兴橡胶衍生物6PPD及其氧化产物6PPD-Q对斑马鱼糖脂代谢的毒性作用及其分子机制，重点关注环境相关浓度（10 μg/L）和亚致死剂量（1/2 LC₅₀）。这两种污染物均能诱导斑马鱼胚胎和幼体的发育畸形，包括孵化延迟、体长缩短、心包水肿、卵黄囊水肿和游泳能力下降。

伦理批准

本研究获得了中国苏州科技大学的伦理委员会批准。

作者贡献声明

常润峰：概念构思、方法学设计、数据整理、初稿撰写。向海鸥：审稿与编辑。严金：数据可视化、实验设计、监督。王泽军：数据可视化、实验设计、监督。钱秋辉：数据可视化、实验设计、监督。王学东：审稿与编辑。吴佳：数据可视化、实验设计、监督。王慧丽：数据可视化、实验设计、监督。

CRediT作者贡献声明

常润峰：初稿撰写、方法学设计、数据整理、概念构思。向海鸥：审稿与编辑。严金：数据可视化、实验设计、监督。王泽军：数据可视化、实验设计、监督。钱秋辉：数据可视化、实验设计、监督。王学东：初稿撰写、审稿与编辑。王慧丽：数据可视化、实验设计、监督。吴佳：数据可视化、实验设计、监督。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本论文工作的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：32371705）和江苏省自然科学基金（项目编号：BK20231341）的共同支持。