生命早期亚微米颗粒物暴露、iNOS甲基化与儿童哮喘/喘息之间的关联

《Journal of Environmental Sciences》：Association between early-life submicron particulate matter exposure, iNOS methylation, and children's asthma/wheezing

孕期PM1暴露与儿童哮喘/喘息风险增加相关，假腺管期敏感，iNOS低甲基化及氧化应激介导炎症反应可能为机制。

　　

刘超群|黄颖|钟颖|杨云燕|聂家英|苏文恩|钟新琪|陈志清|于思文|刘涛

中国广州510632，济南大学医学院公共卫生与预防医学系

摘要

颗粒物（PM₁，空气动力学直径≤1μm）暴露在胎儿肺部发育特定阶段对哮喘风险的影响，以及其可能通过DNA甲基化机制进行调节的作用，目前仍研究不足。因此，我们利用“孕产环境与后代健康”队列数据，对患有哮喘/喘息的儿童进行了嵌套病例对照研究。研究结果表明，孕期的平均PM₁暴露量与儿童哮喘/喘息风险呈正相关（HR=1.39，95% CI：1.02, 1.90），尤其是在假腺体形成期。PM₁暴露与新生儿可诱导的一氧化氮合酶（iNOS）甲基化水平呈负相关（IQR=4.44 μg/m³，β=-1.19%，95% CI：-2.23%至-0.15%）。此外，新生儿iNOS甲基化水平增加5.6%（四分位数范围）与儿童哮喘/喘息风险降低相关（OR=0.62，95% CI：0.43, 0.88）。体外实验显示，PM₁可增加一氧化氮（NO）的产生和iNOS的表达，并降低iNOS的甲基化程度。此外，PM₁还会在人支气管上皮（HBE）细胞中诱导活性氧（ROS）的积累和促炎反应，激活NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体以及caspase-1促凋亡通路，同时激活caspase-3和caspase-9。NF-κB的表达也有所增加。综上所述，母亲在孕期暴露于PM₁与儿童哮喘/喘息有关，尤其是在假腺体形成期，这种效应可能与iNOS甲基化减少以及氧化应激和炎症加剧有关，可能涉及iNOS/NLRP3/NF-κB信号通路。

引言

哮喘是一种慢性炎症性疾病，其特征是气流阻塞和支气管痉挛，导致呼吸困难及喘息，影响所有年龄段的人群（Porsbjerg等，2023）。近一半的哮喘患儿在3岁时至少出现过一次喘息症状，因此儿童喘息常被视为哮喘的早期迹象（Kwong和Bacharier，2019）。哮喘的患病率仍在上升，尤其是在5岁以下儿童中（Asher等，2006；Pedersen等，2011）。在中国，哮喘患者数量已达到3000万，哮喘死亡率居高不下（Chen等，2013）。然而，中国的儿童哮喘控制情况仍不理想，呈上升趋势（Rosa等，2017；Shipp等，2023）。

儿童哮喘/喘息的病因尚未完全明了，但环境因素起着重要作用。流行病学研究表明，环境中的颗粒物（PM）对哮喘/喘息有不良影响。与PM_2.5（空气动力学直径≤2.5 μm的细颗粒物）相比，PM₁（空气动力学直径≤1 μm的亚微米颗粒物）体积更小、表面积更大，携带有毒有害物质的能力更强，对气候和健康的危害更大，对呼吸组织的毒性也更高（Hamra等，2014）。PM₁是PM_2.5的重要组成部分，对人类健康和空气质量都有显著影响。研究表明，在中国大气中，PM₁占PM_2.5的比例超过80%，表明PM₁已成为大气细颗粒物污染的主要来源（Chen等，2018；Qiao等，2016）。然而，PM₁与儿童哮喘/喘息发展之间的具体关系尚不清楚，尤其是在生命早期。

目前，大多数流行病学研究通常使用整个孕期的平均PM浓度或孕期的三个固定阶段（早期、中期和晚期）作为研究其与儿童哮喘相关性的框架（Lavigne等，2017；Lavigne等，2018）。学术界越来越关注胎儿肺部发育的各个阶段，包括胚胎期（妊娠0-6周）、假腺体形成期（妊娠6-16周）、导管期（妊娠16-24周）、囊泡期（妊娠24-36周）和肺泡期（妊娠36周及以后）（Clair等，2022；Morrisey等，2013；Smith等，2010）。因此，有必要研究PM₁是否是中国儿童哮喘/喘息的重要诱因。不同大小的颗粒物对儿童呼吸健康的毒性影响可能有所不同，尤其是在胎儿肺部发育的五个关键阶段。因此，这一领域亟需进一步研究。

空气污染导致哮喘/喘息的生物学机制尚不完全清楚。近年来，一些学者提出，遗传因素可能作为环境因素与易感基因之间的纽带，在哮喘发病机制中起关键作用（Kabesch和Adcock，2012；Salam，2014）。DNA甲基化是哮喘中的一个重要表观遗传机制，主要发生在CpG二核苷酸上，即通过DNA甲基转移酶（Dnmts）将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。在胚胎发育过程中，DNA甲基化由DNMT3A/3B建立，并由DNMT1维持（Liao等，2015）。可诱导的一氧化氮合酶（iNOS）是一种催化L-精氨酸生成一氧化氮（NO）的酶，其启动子活性可被DNA甲基化抑制。一项美国出生队列研究发现，iNOS的低甲基化与儿童哮喘/喘息风险增加相关（Breton等，2012）。体外实验表明，iNOS基因甲基化的下调会导致气道上皮细胞中iNOS基因过度表达，从而增加NO水平和气道炎症反应（Baccarelli等，2012；Roos等，2014）。NLRP3炎症小体是由NLRP3（含有NACHT、LRR和PYD结构域的蛋白质3）组成的复合体，能够识别微生物模式、内源性危险信号和环境刺激物（Fu和Wu，2023）。研究表明，PM_2.5暴露可触发Nrf2/NLRP3信号通路介导的炎症反应（Chu等，2019；Fan等，2023）。目前尚不清楚PM₁是否可作为中介因素，影响气道上皮细胞的功能。

本研究旨在评估早期PM₁暴露与儿童哮喘和喘息之间的iNOS甲基化关系。此外，我们使用人支气管上皮（HBE）细胞验证了iNOS/NLRP3信号通路在调节环境PM₁诱导的炎症和凋亡中的作用。这些结果有助于理解孕期PM₁暴露对后代健康的影响，并为制定有效干预措施提供依据。

研究参与者

本研究基于“孕产环境与后代健康”（PEOH）队列的数据，该队列于2016年1月1日至2020年12月30日在广州市开展（Chen等，2021；Dong等，2020）。该队列对接受住院分娩的孕妇及其后代进行了流行病学调查，成功招募了4,928名参与者并建立了个人档案，随后对其进行了随访。

研究参与者特征

本研究最终纳入了3725对母婴，其中儿童哮喘或喘息的发病率为10.52%（n=392）。在此基础上，建立了一个嵌套病例对照研究，以患有哮喘或喘息的儿童作为病例组。病例组中有142名儿童出现哮喘/喘息症状，对照组有232名儿童。

讨论

空气污染每年导致全球超过700万人过早死亡，其主要原因是颗粒物（PM），但研究人员尚未完全了解其呼吸道毒性机制（Cohen等，2017）。最新证据表明，孕期母亲暴露于大气中的PM₁会增加后代患哮喘/喘息的风险（Hehua等，2017；Hwang等，2013；Norb?ck等，2019）。在这项中国的前瞻性出生队列研究中，我们证实了母亲较高的PM₁暴露水平...

结论

孕期母亲暴露于PM₁与儿童哮喘/喘息风险增加有关，假腺体形成期可能是敏感的暴露窗口。此外，较高的PM₁暴露水平与新生儿iNOS甲基化降低相关，尤其是在导管期，而这种iNOS甲基化减少与儿童哮喘/喘息风险增加有关。体外研究表明，PM₁暴露可能引发氧化应激...

作者贡献声明

刘超群：概念设计、方法论、撰写-审稿与编辑。黄颖：撰写-初稿、软件使用、方法论。钟颖：撰写-初稿、数据分析。聂家英：调查、软件使用、数据分析。杨云燕：数据管理、调查。苏文恩：数据管理、调查。钟新琪：资源获取、验证。陈志清：方法论、数据可视化。于思文：数据可视化、数据分析。刘涛：项目资助。

伦理批准

PEOH研究获得了广东省疾病控制与预防中心伦理委员会的批准（W96-027E-2015001）。所有参与者均签署了知情同意书。

作者贡献声明

刘超群：撰写-审稿与编辑、方法论、概念设计。黄颖：撰写-初稿、软件使用、方法论。钟颖：撰写-初稿、数据分析。杨云燕：调查、数据管理。聂家英：软件使用、调查、数据分析。苏文恩：调查、数据管理。钟新琪：资源获取、验证。陈志清：数据可视化、方法论。于思文：数据可视化、数据分析。刘涛：项目管理。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号42075173、42175181和42375180）和广东省基础与应用基础研究基金（项目编号2024A1515012088）的支持。