《Journal of Global Antimicrobial Resistance》：Evaluating the performance of the InnowaveDx MTB/RIF/INH for simultaneous detection of
Mycobacterium tuberculosis and resistance to rifampicin and isoniazid
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本研究针对中国耐多药/利福平耐药结核病(MDR/RR-TB)早期准确诊断的迫切需求，评估了InnowaveDx MTB/RIF/INH检测技术在同步检测结核分枝杆菌(MTB)及利福平(RIF)和异烟肼(INH)耐药性方面的性能。结果表明，该技术检测MTB的灵敏度为68.0%，高于涂片、培养和Xpert；特异性达97.1%。其与表型药敏试验(pDST)及Xpert检测RIF耐药性的一致性Kappa值分别为0.783和0.940；与pDST及MMCA检测INH耐药性的一致性Kappa值分别为0.915和1。该研究为MDR/RR-TB的快速分子诊断提供了新的有效工具，具有重要的临床意义。
结核病（Tuberculosis, TB）至今仍是全球最重大的传染病挑战之一，而耐多药结核病（Multidrug-Resistant Tuberculosis, MDR-TB）和利福平耐药结核病（Rifampicin-Resistant Tuberculosis, RR-TB）的流行更是给全球结核病防控工作带来了严峻威胁。世界卫生组织（WHO）估计，2023年全球约有40万新发MDR/RR-TB病例。在中国，结核病负担依然沉重，同年约有74.1万结核病患者，其中MDR/RR-TB病例估计达2.9万例。MDR/RR-TB的诊断和治疗尤为困难，其传统“金标准”——表型药物敏感性试验（Phenotypic Drug Susceptibility Testing, pDST）耗时长（数周）、操作复杂，难以满足临床对快速诊断的迫切需求，从而导致治疗延迟，并增加了传播风险。
在此背景下，分子诊断技术因其快速、灵敏的特点而成为结核病诊断领域的革命性工具。自2010年起，WHO推荐使用Xpert MTB/RIF（简称Xpert）技术作为疑似MDR/RR-TB的初始快速诊断方法。Xpert可在约2小时内检测出结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）及其对利福平（Rifampicin, RIF）的耐药性，极大地缩短了诊断时间。然而，Xpert的一个显著局限是它仅检测利福平耐药性，而无法同步检测对另一关键一线药物异烟肼（Isoniazid, INH）的耐药性。在中国，约有23%的RR-TB病例并非MDR-TB（即同时对异烟肼和利福平耐药），这意味着仅凭利福平耐药结果不足以准确预测MDR-TB。漏检异烟肼单耐药结核病可能导致患者接受不适当的治疗方案，影响疗效并增加复发风险。因此，开发一种能够同步、快速、准确地检测MTB以及利福平和异烟肼耐药性的新型诊断工具，对于实现MDR/RR-TB的早期精准诊断和优化治疗策略至关重要。
为解决这一临床诊断瓶颈，来自浙江省中西医结合医院浙江省结核病诊治中心的研究团队开展了一项研究，旨在评估一款新型分子诊断产品——InnowaveDx MTB/RIF/INH（以下简称InnowaveDx）检测技术的诊断性能。该技术由苏州创澜生物科技（苏州）有限公司开发，是第一代InnowaveDx检测技术的升级版，新增了异烟肼耐药性检测功能。相关研究成果已发表于《Journal of Global Antimicrobial Resistance》。
为了全面评估InnowaveDx的性能，研究人员于2023年2月至10月期间，在浙江省中西医结合医院连续招募了研究对象。研究人群主要包括两类：疑似肺结核患者（用于评估对结核病的诊断能力）和耐药结核病高危人群（用于评估对利福平和异烟肼耐药性的检测能力）。最终共有351名患者被纳入最终分析，其中经临床最终诊断确认的活动性肺结核患者247例，非结核性疾病患者104例。所有入组患者均提供了足量的痰液标本，并同步进行了InnowaveDx、抗酸杆菌（Acid-Fast Bacilli, AFB）涂片、BACTEC MGIT 960系统（MGIT）培养和Xpert MTB/RIF检测。对于培养阳性的标本，还额外进行了表型药敏试验（pDST）和multicolor melting curve analysis (MMCA)基因突变检测。此外，对于检测结果不一致的样本，研究人员还进行了基因测序以探究原因。
本研究采用了几项关键的实验室技术。首先是BACTEC MGIT 960系统培养和表型药敏试验（pDST），该方法被视为结核病诊断和耐药性检测的参考标准之一，但其周期较长。其次是Xpert MTB/RIF检测，这是一种成熟的自动化分子检测平台，用于快速检测MTB和利福平耐药性。第三是multicolor melting curve analysis (MMCA)，这是一种分子技术，用于检测与异烟肼耐药相关的基因（如katG, inhA, aphC）突变。最后是本研究评估的核心技术——InnowaveDx MTB/RIF/INH检测，该技术采用磁珠法全自动提取核酸，并通过实时荧光PCR技术，在约2小时内同步检测MTB（靶向多拷贝的IS6110序列以提高灵敏度）以及利福平（靶向rpoB基因五个高频突变区）和异烟肼（靶向katG315、inhA启动子区、aphC等基因）的耐药性。其原理是通过计算突变探针与保守区探针的循环阈值（Cycle Threshold, Ct）差值来判断耐药性。
3.1. InnowaveDx在检测MTB方面的性能
以临床最终诊断为参考标准，InnowaveDx检测MTB的灵敏度为68.0%（95% CI: 61.8–73.8%），显著高于AFB涂片（46.6%）、MGIT培养（48.6%）和Xpert（63.2%）（P < 0.001）。其特异性为97.1%（95% CI: 91.8–99.4%），显著高于AFB涂片（P < 0.001），与MGIT培养和Xpert无显著差异。在AFB涂片阴性的肺结核患者中，InnowaveDx和Xpert的检出率均显著高于MGIT培养。特别值得注意的是，在Xpert检测结果为“未检出”的肺结核患者中，InnowaveDx额外检出了12例（13.2%）肺结核病例，后续的IS6110基因测序证实了这些均为真阳性病例，这得益于InnowaveDx靶向的多拷贝IS6110序列相较于Xpert靶向的单拷贝rpoB基因所具有的灵敏度优势。
3.2. InnowaveDx在检测RIF和INH耐药性方面的性能
以MGIT pDST为参考标准，InnowaveDx检测利福平耐药性的灵敏度和特异性分别为92.9%和91.3%。以Xpert为参考标准，其灵敏度和特异性分别为95.8%和98.2%。一致性分析显示，InnowaveDx与MGIT pDST及Xpert在检测利福平耐药性方面的Kappa值分别为0.783和0.940，表明具有良好至优秀的一致性。
在异烟肼耐药性检测方面，以MGIT pDST为参考标准，InnowaveDx的灵敏度和特异性分别为90.9%和98.9%。以MMCA为参考标准，其灵敏度和特异性均达到100%。一致性分析显示，InnowaveDx与MGIT pDST及MMCA在检测异烟肼耐药性方面的Kappa值分别为0.915和1，表明一致性极佳。
3.3. RIF和INH耐药性检测不一致结果分析
研究中共发现11例利福平耐药性检测不一致的情况。通过基因测序和MGIT pDST临界浓度（Critical Concentration, CC）的系列稀释验证，发现其中7例不一致是由于边界耐药突变（borderline resistance mutations） 所致。即InnowaveDx和Xpert均检测到rpoB基因突变（如Leu511Pro, His526Asn, His526Leu等），提示耐药，但使用标准临界浓度（1.0 mg/L）的MGIT pDST却显示敏感。然而，当使用更低的药物浓度进行测试时，部分菌株在低至0.125 mg/L的浓度下仍能生长，证实了其存在低度耐药性或边界敏感性。这种不一致反映了分子检测能更早地识别出这些可能导致表型检测结果模糊的基因突变。
在异烟肼耐药性检测方面，共发现4例不一致情况。其中3例MGIT pDST显示耐药而InnowaveDx和MMCA显示敏感，测序结果为野生型，提示表型检测可能存在假阳性或由其他耐药机制引起。另1例MGIT pDST显示敏感而InnowaveDx和MMCA显示耐药，测序发现了inhA-15C>T突变，证实了分子检测结果的准确性。
本研究得出结论，InnowaveDx MTB/RIF/INH检测技术在检测结核分枝杆菌以及利福平和异烟肼耐药性方面表现出良好的性能。其检测MTB的灵敏度优于传统方法，尤其在对涂片阴性或细菌载量低的样本检测中显示出优势。在耐药性检测方面，与表型药敏试验和现有分子方法具有高度一致性。研究中观察到的不一致结果，特别是利福平耐药性检测方面，主要归因于边界耐药突变，这凸显了分子检测在识别这些微妙基因变化方面的价值，以及表型药敏试验结果解读的复杂性。
该研究的重要意义在于，InnowaveDx作为一种新型的集成化分子诊断平台，能够在一次检测中同步提供MTB存在与否以及两种关键一线药物（利福平和异烟肼）的耐药信息，且检测时间短（约2-3小时）。这为临床医生快速制定或调整MDR/RR-TB患者的治疗方案提供了更为全面和及时的实验室依据，有望弥补当前广泛使用的Xpert MTB/RIF在异烟肼耐药信息缺失方面的不足，从而促进结核病，特别是耐药结核病的精准诊疗。当然，本研究作为单中心研究，其结果需要在更广泛的人群和不同流行病学 settings 中进行进一步验证。此外，随着Xpert MTB/XDR等更全面的分子检测技术在全球范围内的应用，未来的比较研究将能更全面地评估各类新技术的相对优势。尽管如此，InnowaveDx的出现无疑为中国乃至全球的结核病防治工具箱增添了又一个有力的选项。
