农药导致日本青鳉下丘脑-垂体-性腺轴紊乱的分子机制和组织病理学基础

《Journal of Hazardous Materials》：Molecular and histopathological mechanisms underlying pesticide-induced disruption of the hypothalamic–pituitary–gonadal axis in Japanese Medaka

农药混合物对日本 medaka 繁殖轴的协同毒性及氧化应激机制研究

　　

穆罕默德·贾瓦德（Muhammad Jawad）|萨娜·纳西尔（Sana Nasir）|徐海静（Haijing Xu）|王亚玲（Yaling Wang）|秦世军（Shijun Qin）|王阿敏（Aimin Wang）|倪红（Ni Hong）|李明友（Mingyou Li）

教育部重点实验室——水生遗传资源探索与利用实验室，上海海洋大学，中国上海 201306

摘要

农药的广泛使用引发了人们对它们对水生生物综合影响的严重担忧；然而，其生殖毒性的潜在机制仍不明确。成年日本青鳉（Oryzias latipes）被暴露于芬威利特（FEN，0.039 mg/L）、特布康唑（TEB，1.0 mg/L）或其混合物（FEN + TEB，0.01 mg/L + 0.5 mg/L）中60天，以评估这些物质对下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的单一和混合诱导的干扰。长期暴露于FEN或TEB中均显著降低了受精率、孵化率和存活率，而混合暴露组的不良影响最为严重。生殖腺组织学评估显示严重的退行性变化、精子发生障碍、生殖细胞减少、卵泡闭锁以及结构完整性丧失。转录组分析进一步表明HPG轴存在广泛紊乱，cyp19a1、dmrt1、fshr、gnrh1、gnrh2、lhβ和star的基因表达显著下调，而erα、erβ、fshβ、vtg1和vtg2的基因表达则呈现性别依赖性变化。观察到的配子发生障碍可能归因于转录调控失调，因为分子对接实验显示FEN和TEB能够稳定结合到Dmrt1和芳香化酶（Cyp19a1）上。此外，生化检测证实FEN和TEB的共同暴露还导致了氧化应激和免疫抑制，表现为CAT、GSH-PX、LZM和SOD活性降低以及MDA水平升高。这些发现提供了分子和组织病理学证据，证明FEN和TEB协同作用破坏了鱼类的内分泌信号传导，引发了氧化失衡，并损害了生殖腺的完整性，突显了水环境中农药混合物的生态风险。

引言

现代农业系统严重依赖农药的应用来维持高作物产量并减少害虫造成的损失[1]。然而，这些化学物质中有很大一部分（估计超过99%）未能到达目标生物体，而是扩散到陆地和水生生态系统中，对非目标物种（包括人类）产生影响[2]。它们的环境持久性可能导致土壤和水体污染，引发一系列生态紊乱，如群落组成变化、食物网中断和物种丰富度下降[3]。人类也通过多种途径长期暴露于低剂量的多种农药中，这引发了人们对累积毒性效应的担忧，即使在低于阈值的情况下也是如此[4]。令人担忧的是，农业地区的地表水监测显示，超过一半的采样地点的农药浓度超过了安全标准[5]，进一步证明了农药径流的深远后果。长期暴露于这些残留物与生殖障碍、神经发育缺陷、免疫毒性、内分泌紊乱和致癌作用有关[6]。值得注意的是，水生生物通常不是单独接触某种化合物，而是接触复杂的混合物，而目前评估模型对这些混合物的联合毒性了解不足[7]、[8]。 芬威利特（FEN）是一种II型合成拟除虫菊酯，因其对多种农业害虫的强效性而被广泛用作传统杀虫剂的替代品[9]。尽管它具有疏水性且通常环境生物利用度较低，但FEN可以通过水、沉积物和空气传播，从而在水中生物体内积累[10]、[11]。其在水生环境中的持久性表现为半衰期约为4.75至11.95天，表明其稳定性适中[12]、[13]。监测研究在地表水中检测到FEN的浓度范围为0.017至0.021 μg/L，而农业径流和雨水系统中的浓度可高达39.7 μg/L[10]、[14]。实验证据表明，FEN暴露会损害多个生理系统，特别是与生殖、神经内分泌信号传导和免疫调节相关的系统[15]、[16]。据报道，FEN通过内分泌途径和基因水平调节机制干扰了多种鱼类的生殖功能。暴露于FEN的成年斑马鱼表现出肝卵黄蛋白合成减少（这是一种受雌激素调控的关键过程）和产卵效率下降，表明雌激素依赖的生殖途径受到干扰[17]。在稀有鲦鱼（Gobiocypris rarus）中，同时暴露于FEN和三唑酮的胚胎表现出协同的发育毒性和内分泌终点紊乱，表明可能在基因水平上干扰了类固醇生成信号传导[18]。最近的研究表明，斑马鱼在120小时内暴露于100 μg/L的FEN会加剧氧化应激并下调与神经发生相关的基因表达[19]，同时伴随着游泳活动减少——这些行为与生殖适应性密切相关。总体而言，这些跨物种的研究表明，FEN通过直接调节雌激素调控基因（如卵黄蛋白）或更广泛的神经内分泌途径影响生殖内分泌系统，因此被归类为一种干扰鱼类内分泌的化合物。 特布康唑（TEB）是一种广泛使用的三唑类杀菌剂，因其干扰类固醇生成信号传导和生殖基因表达的能力而被认为是一种水生生物的内分泌干扰物[20]。由于其相对较高的水溶性，TEB可以通过农业径流轻易进入水生环境，其应用范围广泛，导致地表水中的浓度范围为0.6至200 μg/L[21]。除了水生系统外，TEB暴露还与哺乳动物的多种毒性效应有关，包括神经毒性、免疫毒性、致癌性和生殖及内分泌功能的紊乱[22]、[23]。在斑马鱼（Danio rerio）中，发育期间的长期TEB暴露会导致性别偏向的性别分化、生殖细胞数量减少以及卵子产量显著下降。这些生殖障碍伴随着卵巢E2水平降低、E2/T（睾酮）比率降低以及关键生殖基因（如cyp19a1a（芳香化酶）和esr2b（雌激素受体β）的转录抑制[24]。在成年斑马鱼中，21天的TEB暴露（0.4–1.6 mg/L）导致卵子产量减少、受精率降低、精子活力下降、生殖腺形态改变和社会行为紊乱；这些生殖障碍与激素水平（E2、T）的变化以及HPG轴和相关基因的转录失调相吻合。机制研究进一步表明，TEB通过抑制芳香化酶（Cyp19A）和下调转录因子FoxL2（调节卵巢分化和芳香活性）来损害鱼的生殖功能，这一过程是通过抑制FoxL2的磷酸化实现的。 下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴是调节两性生殖过程的核心内分泌途径[25]。在该轴中，由下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）通过门脉循环与其在前垂体中的受体结合，刺激黄体生成激素（LH）和卵泡刺激激素（FSH）的分泌[26]。这些促性腺激素作用于特定的生殖细胞，控制配子发生和类固醇生成。在雌性中，LH与黄体间质细胞上的黄体生成激素-绒毛膜促性腺激素受体结合，通过调节star、cyp17a1、hsd3b1和hsd3b2等类固醇生成基因来促进雄烯二酮和睾酮的产生。LH还刺激黄体细胞中的孕酮合成，并对GnRH的释放产生负反馈。同时，FSH作用于颗粒细胞，通过cyp19a1和hsd17b1的转录调节促进雄激素向E2的转化，从而促进卵泡发育、排卵和生殖器官的生长[27]、[28]、[29]。在雄性中，LH刺激莱迪希细胞中的睾酮合成，而FSH作用于塞托利细胞，促进雄激素结合蛋白（ABP）的分泌，维持高水平的管内睾酮，这对精子发生和精子成熟至关重要。FSH还通过诱导抑制素和激活素的分泌来调节HPG轴的反馈[30]。总体而言，成功的生殖依赖于HPG轴内信号事件的精确协调（图1）。越来越多的证据表明，这一轴极易受到环境污染物的干扰，使其成为研究生殖毒性的关键目标[31]、[32]、[33]、[34]。 尽管越来越多的证据表明单一农药可以干扰内分泌信号传导，但拟除虫菊酯和三唑类杀菌剂对鱼类HPG轴的联合效应仍不清楚。最近对日本青鳉（O. latipes）的综合性毒理学研究表明，FEN和TEB的联合暴露可引起多个器官（包括肠道和肝脏）的分子和组织病理学变化[35]，表明混合物诱导的内分泌和代谢紊乱可能扩展到HPG轴。为了填补这一空白，我们研究了FEN和TEB对成年日本青鳉（O. latipes）的单独和联合影响，这种模式物种因其生命周期短、遗传易接近性和对内分泌干扰化学物质的高敏感性而被广泛用于生殖毒理学研究[36]、[37]、[38]。我们的评估包括生殖腺组织学、生殖结果（受精率、产卵率和存活率）以及两性关键脑-垂体和生殖相关基因的转录组分析。此外，还分析了与生殖和内分泌调节相关的肝脏基因表达。这种综合设计提供了关于FEN和TEB如何破坏HPG轴的新机制见解，并加深了我们对混合物毒性及其对水生生物生殖健康影响的理解。

实验生物和化学物质

实验生物和化学物质

本研究使用了四个月大的日本青鳉（Oryzias latipes，HdRr品系；野生型），体重通常为0.15–0.20克，体长约3.0–3.5厘米，在上海海洋大学内部的繁殖系统中饲养。因此，每6升水养殖20条鱼，这与先前发表的青鳉研究和OECD测试指南203的建议一致[39]、[40]。暴露前，鱼在充氧、去氯的水环境中进行了两周的适应期。

对受精率、孵化率和死亡率的影响

FEN、TEB及其混合物（FEN+TEB）的暴露导致日本青鳉的生殖性能和胚胎活力显著受损（见图S1）。在对照组中，受精率和孵化率保持较高（分别为95.8±1.6%和93.2±2.1%），死亡率较低（2.1±0.5%）。然而，FEN暴露导致受精率（89.4±2.3%）和孵化率（85.6±3.0%）略有但统计上不显著的下降。

讨论

下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴在协调脊椎动物的生殖过程中起着核心作用，它将下丘脑信号与垂体激素释放相结合，以调节生殖腺类固醇生成、配子发生和成熟。因此，这一精细调节的内分泌级联的破坏会对生殖能力和种群可持续性产生深远影响。在本研究中，FEN、TEB的暴露，特别是它们的混合物暴露改变了HPG轴的功能

结论

总之，本研究表明，FEN和TEB的联合暴露在多个调控水平上破坏了成年青鳉的HPG轴，涉及下丘脑神经肽、垂体促性腺激素和生殖腺类固醇生成，氧化应激是毒性的关键介质。联合暴露比单独暴露产生了更强和更综合的效果，表明存在加性和协同作用。从机制上看，gnrh1和gnrh2的抑制表明...

环境影响声明

本研究表明，单独或联合暴露于芬威利特和特布康唑会在鱼类中通过破坏HPG轴产生协同的生殖毒性，损害生殖腺结构，并引发氧化应激和免疫失衡。这些农药与关键内分泌调节因子的强烈分子相互作用突显了它们改变激素信号传导和生殖成功的潜力。这些发现强调了迫切需要评估...

CRediT作者贡献声明

李明友（Mingyou Li）：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念构思。倪红（Ni Hong）：撰写——审稿与编辑、资源管理、研究、概念构思。王阿敏（Aimin Wang）：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。秦世军（Shijun Qin）：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。王亚玲（Yaling Wang）：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。徐海静（Haijing Xu）：撰写——审稿与编辑、方法学

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32373130）的资助和支持。