METTL1介导的m7G tRNA修饰通过调控ATPIF1翻译效率及线粒体能量代谢减轻心肌缺血再灌注损伤

《MedComm》：METTL1-Mediated N7-Methylguanosine tRNA Modification Alleviates Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury by Modulating Mitochondrial Energy Metabolism

本文揭示了METTL1介导的N7-甲基鸟苷（m7G）tRNA修饰在心肌缺血再灌注（I/R）损伤中的关键作用。研究发现METTL1通过调控tRNA稳定性及ATP酶抑制因子1（ATPIF1）的翻译效率，影响线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能，进而调节心肌细胞凋亡。该研究为心肌I/R损伤的靶向治疗提供了新策略（METTL1/ATPIF1通路）。

　　

METTL1介导的m⁷G tRNA修饰在心肌缺血再灌注损伤中的调控机制

1 引言

缺血性心脏病是全球发病率和死亡率最高的疾病之一。心肌梗死（MI）患者常通过经皮冠状动脉介入治疗或溶栓疗法恢复血流，但血运重建可能导致心肌缺血再灌注（I/R）损伤。线粒体功能障碍、氧化应激和钙超载等机制参与其中，但目前针对I/R损伤的治疗策略仍不足。转移RNA（tRNA）是解码遗传密码和蛋白质合成的关键分子，其N⁷-甲基鸟苷（m⁷G）修饰是高度保守的修饰类型，主要位于tRNA可变环第46位点，由甲基转移酶METTL1及其调控单元WDR4组成的复合物催化。研究表明METTL1在肿瘤中高表达，但其在心脏I/R损伤中的作用尚不明确。ATP酶抑制因子1（ATPIF1）是线粒体保守蛋白，可抑制F₁-F₀ATP合酶活性，但其在心血管疾病中的作用存在争议。本研究旨在探索METTL1-m⁷G-ATPIF1轴在心肌I/R损伤中的分子机制。

2 结果

2.1 METTL1介导的m⁷G tRNA修饰在心肌I/R损伤中上调

在I/R损伤小鼠心脏和缺氧/复氧（H/R）处理的心肌细胞中，m⁷G tRNA修饰水平显著升高。同时，急性心肌梗死（AMI）患者和小鼠血浆中m⁷G水平也明显上升。Western blot和qRT-PCR结果显示，I/R心脏及H/R心肌细胞中METTL1和WDR4的蛋白和mRNA表达均上调。免疫组化染色进一步证实I/R心脏中METTL1表达增加。这些数据表明m⁷G tRNA修饰和METTL1/WDR4复合物在心脏I/R损伤中发挥重要作用。

2.2 抑制METTL1改善心脏I/R损伤

通过CRISPR/Cas9技术构建METTL1基因敲除（METTL1^+/?）小鼠模型，发现敲除METTL1可显著改善I/R损伤后的心功能，表现为射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）的恢复。I/R后升高的乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白T（cTn-T）水平在METTL1^+/?小鼠中明显降低。梗死面积缩小，心肌结构改善，炎症细胞浸润减少。TUNEL染色显示凋亡细胞减少，Western blot检测发现促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3下调，抗凋亡蛋白Bcl2和XIAP上调。体外实验中，转染METTL1-siRNA的心肌细胞也表现出类似的抗凋亡效应。

2.3 METTL1缺失通过改善线粒体功能障碍调节心脏损伤

核糖体分析测序显示，METTL1敲低后翻译效率下调的mRNA富集于线粒体和ATP相关通路。I/R心脏和H/R心肌细胞中ATP含量下降，而METTL1敲除可恢复ATP产量。线粒体氧消耗率（OCR）、基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸容量和ATP产量在H/R处理后均降低，但METTL1沉默可逆转这些变化。JC-1染色显示METTL1敲除恢复线粒体膜电位，MitoSOX染色表明线粒体活性氧（ROS）生成减少，mPTP开放被抑制。此外，METTL1缺失促进线粒体融合蛋白OPA1和Mfn2表达，抑制裂变蛋白Drp1和Fis1，减少细胞色素c泄漏和cleaved-caspase9活化，表明METTL1沉默可抑制线粒体凋亡。

2.4 METTL1调控m⁷G tRNA修饰、tRNA表达及全局mRNA翻译

tRNA测序和m⁷G tRNA甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）鉴定出23种携带m⁷G修饰的tRNA。METTL1敲低显著降低m⁷G修饰水平和m⁷G修饰tRNA的表达，但对非m⁷G修饰tRNA影响较小。嘌呤霉素摄入实验表明METTL1过表达增强全局mRNA翻译，而敲低则抑制翻译。KEGG分析提示翻译效率下调基因富集于氧化磷酸化通路。

2.5 METTL1通过ATPIF1调控心脏损伤

核糖体分析显示METTL1敲低后ATPIF1、SLC25A3和ATP5G3的翻译效率下降。Western blot验证ATPIF1蛋白水平在METTL1^+/?小鼠心脏中下调，而其mRNA水平无显著变化。I/R心脏和H/R心肌细胞中ATPIF1蛋白上调，AMI患者和小鼠血浆中ATPIF1水平也升高。这些结果提示METTL1通过m⁷G tRNA修饰调控ATPIF1 mRNA翻译，影响线粒体稳态。

2.6 ATPIF1过表达诱导心肌肥大

通过腺相关病毒血清型9（AAV9）载体心脏特异性过表达ATPIF1，发现小鼠心功能受损，心肌重量/体重比（HW/BW）升高，肥大标志物ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达上调，表明ATPIF1过表达可诱导心肌肥大。

2.7 ATPIF1敲低减轻心脏I/R损伤

AAV9介导的ATPIF1敲低改善I/R后心功能，降低LDH、CK-MB、cTn-T水平和梗死面积，减少TUNEL阳性细胞。线粒体膜电位恢复，mPTP开放和线粒体ROS生成受抑制，凋亡相关蛋白表达改善。

2.8 METTL1通过ATPIF1调控线粒体功能障碍

挽救实验显示，共转染ATPIF1过表达质粒可逆转METTL1沉默对H/R心肌细胞的保护作用，表现为OCR、ATP产量下降，线粒体膜电位丧失，mPTP开放增加，凋亡蛋白表达恶化。证明ATPIF1是METTL1的下游效应因子。

2.9 ATPIF1介导METTL1对心脏I/R损伤的影响

在METTL1^+/?小鼠中过表达ATPIF1，可抵消METTL1敲除的心保护作用，心功能恶化，梗死面积和凋亡指标回升，进一步确认ATPIF1在METTL1通路中的核心地位。

3 讨论

本研究首次揭示METTL1-m⁷G-ATPIF1轴在心肌I/R损伤中的作用机制。METTL1通过调节m⁷G tRNA修饰影响ATPIF1翻译效率，进而调控线粒体能量代谢和凋亡。研究为心脏I/R损伤提供了新的治疗靶点。

4 材料与方法

研究使用AMI患者血浆样本和C57BL/6小鼠模型，通过体内外实验结合分子生物学技术（如Western blot、qRT-PCR、Seahorse分析、测序等）验证机制。统计学分析采用t检验或ANOVA。