温带泥滩蓝藻垫微生物群落成员的微尺度空间分布及其生物地球化学意义

《Ecology and Evolution》：Spatial Resolution of Microbial Community Members Within Cyanobacterial Mats From Temperate Mud Flats

本研究通过16S代谢条形码和稳定同位素分析，首次在微尺度上揭示了北卡罗来纳州沙克尔福德滩岛长期存在的底栖蓝藻垫（BCM）垂直分层中细菌群落的精细结构。研究发现，BCM群落主要由变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、浮霉菌门（Planctomycetota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）和蓝藻门（Cyanobacteria）组成。群落组成和多样性在垂直分层间存在显著差异，但与有机质（TOM）、总有机碳（TOC）和总氮（TN）的垂直变化趋势相匹配，揭示了微生物功能分区与关键生物地球化学循环（如碳、氮、硫循环）的紧密联系。该研究为理解温带BCM的形成、持久性及其在沿海生态系统中的功能提供了重要的分子生物学证据。

　　

摘要

底栖蓝藻垫（BCM）是一类以高蓝藻丰度为特征、在全球多种水生和半水生生境中广泛分布的微生物聚集体。本研究利用16S代谢条形码和稳定同位素分析，对美国北卡罗来纳州沙克尔福德滩岛长期存在的BCM垂直分层中的细菌成员进行了微尺度表征。结果表明，空间广阔的BCM主要由变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、脱硫杆菌门、疣微菌门和蓝藻门组成。垫状群落在水平样带上无差异，但在垂直分层层间，其多样性和群落组成均存在差异。有机质、碳和氮有效性的变化趋势与微生物组成和多样性在垂直层面上的变化相匹配。这些发现首次提供了北卡罗来纳州BCM完整细菌群落的分子特征，并深入揭示了该系统内潜在的生物地球化学过程。

1 引言

微生物垫是高度组织化的微生物聚集体，可覆盖大片连续区域，并承担多种生态系统功能，包括保护海岸线免受侵蚀、储存化学能源和营养物质，以及为微型动物提供食物和避难所。BCM作为微生物垫的一种，其微生物组成受多种环境因素调控，这些因素决定了关键的化学和物理条件，从而形成了随空间和时间变化的复杂群落结构。BCM表现出普遍的空间和功能动态，突出了其在驱动多种生态系统中关键循环过程的复杂性和重要性。温带垫状系统已成为研究群落结构和养分循环的模型系统。本研究旨在通过对北卡罗来纳州沙克尔福德滩岛BCM的微尺度群落结构、养分和同位素特征进行研究，补充现有关于BCM结构和功能的文献。

2 材料与方法

2.1 研究地点描述

研究地点位于北卡罗来纳州卡特雷特县沙克尔福德滩岛，该岛是海角卢考特国家海滨的一部分。BCM位于该岛西端一个季节性波动的咸水-超咸水泻湖内及周围，该区域由于免受波浪作用的影响，支持着全年的蓝藻垫群落。

2.2 样品采集

于2024年2月对垫状体进行三次重复采样。使用小型取样器或改良注射器在垫状体靠近沙丘的一侧采集重复样品。生物样本立即保存在DNA/RNA Shield中。采集了两种类型的样本：一种是水平变化实验（从垫状体边缘向中心，在0、30、70、110和150厘米处采集5个岩心）；另一种是垂直变化实验（从垫状体中心采集一个岩心，并根据颜色和质地垂直分割成6层，分别为0-2.5毫米、2.5-7.5毫米、7.5-10毫米、10-20毫米、20-27毫米和27-35毫米）。

2.3 DNA提取与测序

使用Omega E.Z.N.A. Soil DNA Kit从每个保存的岩心样本中提取DNA。使用针对16S V4区的通用细菌条形码515F和806R进行PCR扩增，并添加与Illumina兼容的索引。在Illumina MiSeq平台上进行双端250 bp测序。使用Trim Galore和Cutadapt进行原始读长的质控和引物去除，随后使用DADA2流程进行过滤、合并和嵌合体去除，生成扩增子序列变异（ASV）表。

2.4 代谢条形码分析

使用DADA2中的assignTaxonomy函数和Silva参考数据库（v138.1）对ASV进行物种分类。使用Phyloseq进行后续分析。去除阴性对照、线粒体、叶绿体和古菌变异体后的ASV用于分析。使用中心对数比（CLR）转换数据进行β多样性分析（欧氏距离）和差异丰度分析（使用ANCOM-BC2）。通过方差分析评估α多样性（观察物种数和均匀度）的差异。

2.5 养分与同位素分析

将干燥的BCM生物质样品进行酸洗（用于碳测量）以去除无机碳。使用同位素比值质谱仪测量δ¹³C和δ¹⁵N同位素比值以及总有机碳（TOC）和总氮（TN）百分比。采用灼烧失重（LOI）法测量总有机质（TOM）百分比。使用方差分析或Kruskal-Wallis检验以及事后检验（Tukey HSD或Dunn‘s检验）比较各层间的养分和同位素差异。

3 结果

3.1 垂直变化实验

观察到的物种数（F_6,14= 5.338, p = 0.0047）和均匀度（F_6,14= 4.415, p = 0.0104）在各层间存在显著差异。β多样性也显著不同（F_6,14= 5.5963, p < 0.001）。最丰富的门包括变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、脱硫杆菌门、蓝藻门、绿弯菌门和疣微菌门。共有17个门和27个纲的丰度在各层间存在显著差异（p < 0.001）。拟杆菌门、蓝藻门和绿弯菌门随着深度（缺氧发展）而减少。

3.2 水平变化实验

核心间物种丰富度（F_4,9= 1.256, p = 0.355）、均匀度（F_4,9= 1.881, p = 0.211）和β多样性（F_4,9= 1.22, p = 0.1709）均无显著差异。差异丰度分析显示，只有Patescibacteria门在不同核心间存在显著差异（p < 0.001），但其相对丰度极低（<0.3%）。

3.3 养分与同位素分析结果

总有机质（TOM）、总有机碳（TOC）和总氮（TN）百分比在垫状体各层间无显著差异，但第2层和第3层的TOM和TOC以及第1层和第2层的TN显著高于沙质对照。δ¹³C在垫状体各层间无显著差异，但第4层的δ¹³C显著高于沙质对照。δ¹⁵N在垫状体各层间存在显著差异，第3、4、5、6层的δ¹⁵N值显著高于第1层，第5、6层显著高于第2层，沙质对照的δ¹⁵N值显著高于第1层但显著低于第5、6层。

4 讨论

垫状体表现出垂直分层，不同层次的多样性和群落组成存在差异，这与光、氧化还原电位等关键环境梯度的变化一致。上层（第1、2层）以产氧光养生物（如蓝藻）为主，具有较高的生产力和生物量，积累了丰富的有机质、有机碳和氮。过渡层（约第3、4层）是好氧和厌氧过程的叠加区，δ¹³C出现峰值，可能与代谢方式从产氧光合作用向不产氧光合作用或化能自养的转变有关。深层（第5、6层）以厌氧菌为主（如酸杆菌门、脱硫杆菌门、浮霉菌门），δ¹⁵N值随深度增加，反映了有机质被异养细菌消耗导致的营养级联效应和氮循环过程。未发现水平梯度上的群落结构差异，可能与研究的空间尺度较小或垫状体连续且成熟度均一有关。

5 结论

本研究首次提供了北卡罗来纳州BCM完整细菌群落的分子特征，揭示了其垂直分层中显著的微生物群落结构和功能分化，这些分化与养分和同位素梯度密切相关。研究结果为了解温带BCM的形成、持久性及其在沿海生物地球化学循环中的作用提供了重要基础。未来的研究可通过宏基因组学和宏转录组学进一步阐明群落的具体功能，并扩大研究范围以探索不同地点、季节和非生物指标下的BCM变异。

作者贡献

Schyler A. Ellsworth：主导概念化、数据管理、形式分析、项目协调、可视化、初稿撰写和审阅编辑。Madelina S. Marquez：参与概念化、获取资金、可视化、初稿撰写和审阅编辑。Sophie J. McCoy：参与概念化、主导资金获取、项目协调、监督管理、初稿撰写和审阅编辑。

资金来源

本研究由Phycological Society of America研究资助奖、美国国家科学基金会（OCE-2239425等）和北卡罗来纳大学艺术学院Royster Society Fellowship、启动资金等支持。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

数据可用性声明

本研究中产生的原始测序读数已提交至NCBI序列读长档案（SRA），BioProject编号为PRJNA1337146。用于数据分析的代码可在https://github.com/schyells/DNA_Metabarcoding_Analysis获取。