《Environmental DNA》：Tails of Biodiversity: Vertebrate Community Assessment in a Neotropical River Basin via eDNA Metabarcoding
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本文通过环境DNA（eDNA）宏条形码技术，首次系统评估了巴西圣安东尼奥河上游源头溪流的脊椎动物多样性，揭示了氧化还原电位（ORP）是影响物种丰富度的关键环境因子，而非森林覆盖率或pH值。研究在受采矿活动影响的东西坡地识别出两个不同的生物群落，累计发现119个脊椎动物分类单元，为这片大西洋森林残留地的生物多样性监测与保护决策提供了重要科学依据。
1 引言
人为活动是导致全球生物多样性丧失的主要驱动力，主要体现在栖息地退化、土地利用变化和气候变化等方面。这些驱动因素共同作用，加剧了全球物种丰富度的下降。监测生物多样性趋势是制定明智保护政策和有效管理策略的基础步骤。近年来，通过环境DNA（environmental DNA, eDNA）进行生物监测的方法革新了传统手段。eDNA宏条形码技术减少了物种鉴定所需的工作量，最大限度地减少了形态学鉴定的挑战，并且降低了对特定分类学知识的依赖。此外，eDNA能够同时识别单个环境样本中的多营养级群落。
尽管大多数应用eDNA方法的研究在温带地区开展，但热带地区的生物多样性更高且亟待记录。由于eDNA能够提供快速且成本相对较低的评估，它已成为理解新热带动物区系高物种丰富度的宝贵工具。
位于巴西东南部的圣安东尼奥河流域是多西河流域最大、最原始支流之一。与多西河其他部分相比，圣安东尼奥河流域的环境退化相对较晚，始于20世纪30年代。采矿活动、人口增长和水电站的建设对该河流的生物多样性构成了重大威胁。目前，圣安东尼奥河流域大部分高质量的森林残留地存在于源头地区，即埃斯皮尼亚苏山脉的高海拔区域。
本研究利用eDNA分析了圣安东尼奥河源头溪流中的多营养级脊椎动物群落，包括鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物。研究假设是，土地利用强度的增加会降低分类学多样性并改变多营养级脊椎动物群落的结构组成。预测具有较高森林覆盖率的位点将表现出更高的脊椎动物丰富度。
2 材料与方法
2.1 研究区域
研究在巴西米纳斯吉拉斯州圣安东尼奥河流域的三级和四级溪流中进行。该流域面积10429 km2，包含五条主要支流。圣安东尼奥河发源于埃斯皮尼亚苏山脉，流经约280公里后汇入多西河。该地区气候属于温带多雨气候，年平均降水量1314毫米，年平均气温在21°C至24°C之间。大约88.6%的圣安东尼奥河流域位于大西洋森林生物群系内，其余11.4%位于塞拉多生物群系。
2.2 采样设计与eDNA采集
于2023年4月，在圣安东尼奥河上游流域对15条溪流进行了采样。使用度量均匀设计算法选择采样点以减少空间自相关。在每个溪流点，使用5升无菌一次性塑料袋采集三份水样重复。水样通过聚醚砜膜过滤器进行过滤，使用电池供电的便携式蠕动泵作为封闭系统操作以尽量减少污染。每个采样点使用全新的野外工具包。过滤后，滤膜立即浸入改良的Longmire's缓冲液中以保存DNA。样品在运输过程中避光冷藏，随后在实验室-80°C保存直至分析。未采集现场空白样，但通过使用一次性耗材、封闭过滤系统以及在实验室处理过程中包含提取和PCR空白来弥补此限制。
2.3 测序
使用DNeasy Blood and Tissue提取试剂盒提取eDNA。每个样品批次包含一个由裂解缓冲液组成的提取空白作为阴性对照。使用针对线粒体12S rRNA基因的引物进行扩增，每个样品进行12次PCR重复。每个PCR批次包含阴性对照和阳性对照。由于已知这些引物会扩增灵长类DNA，在第一轮PCR中使用阻断引物来限制非目标人类DNA的扩增。对第二轮（索引）PCR的扩增子进行纯化，通过凝胶电泳检查，并进行定量。使用Illumina MiSeq系统进行测序。
2.4 生物信息学分析
对原始序列进行解复用、合并、引物修剪和质量过滤。然后进行去重复，生成零半径操作分类单元（zOTUs）。使用UNOISE算法对读数进行降噪以最小化假阳性。保留的zOTU要求至少在一個样本中具有不少于8条读长的最小丰度。使用BLASTn对每个zOTU进行共识分类学分配，搜索NCBI核苷酸数据库。分类分配需要满足最低相似度阈值。将高质量序列聚类为操作分类单元（OTUs），并过滤掉低丰度OTUs。对所有具有物种水平鉴定的OTU，查询IUCN红色名录等数据库以获取其保护状态和入侵状态信息。
2.5 环境变量
在采样点周围500米缓冲区内评估土地利用情况，并与MapBiomas项目提供的2022年30米分辨率土地利用和植被地图叠加。测量了每个点位到最近采矿活动的距离。使用多参数探头测量每个点位的环境变量，包括电导率（COND）、溶解氧（DO）、pH、氧化还原电位（ORP）、水温（WT）和气温（AT）。
2.6 数据分析
绘制物种累积曲线以估计达到渐近线所需的采样努力量。使用主成分分析（PCA）评估不同变量如何影响生物群落的分布和组成。计算每个采样点的多样性指数。基于S?rensen相异性指数计算总β多样性，并分解为物种周转（βSim）和嵌套性（βNes）组分。使用PERMANOVA和db-RDA分析群落组成变异与环境及土地利用预测因子的关系。使用线性混合模型（LMM）模拟脊椎动物丰富度与环境变量的关系。
3 结果
3.1 多营养级群落
通过水样eDNA测序，在圣安东尼奥河流域揭示了50个科，分属辐鳍鱼纲（Actinopterygii）、两栖纲（Amphibia）、鸟纲（Aves）和哺乳纲（Mammalia）。未检测到爬行动物。在15个溪流系统中，共检测到119个脊椎动物OTUs，包括40个鱼类OTUs、12个两栖动物OTUs、32个鸟类OTUs和35个哺乳动物OTUs，涉及1门、4纲、24目、50科、77属和62个物种。Chao2估计器表明物种累积曲线未达到渐近线，暗示流域内脊椎动物OTU丰富度可能随着采样努力量的增加而翻倍，可能超过240个OTUs。
PCA分析显示，前两个主成分解释了56%的方差。PC1与距采矿点距离、OTU丰富度、ORP呈正相关，与水温、气温呈负相关。PC2与森林覆盖率、气温呈正相关，与人为土地利用比例呈负相关。聚类分析显示，群落明显分为两大组，分别对应于流域西坡的圣安东尼奥克鲁塞罗溪和东坡的佩希河。群落组成差异主要受流域坡向、距采矿点距离和ORP的影响。β多样性分析表明，OTU组成的变化有15%源于总β多样性，其中10%由物种周转贡献，5%由嵌套性贡献。对于总脊椎动物丰富度，ORP是最强的预测因子，而森林覆盖率、pH和距采矿点距离则无显著关联。按类别分析，鱼类和哺乳动物的丰富度随ORP增加而增加，而两栖动物和鸟类的丰富度与测试的环境变量均无显著相关。
3.2 脊椎动物生物多样性
研究发现40个鱼类OTUs，可鉴定为5目13科23属17种。最具多样性的鱼类科是脂鲤科。约70%的鱼类物种在四个或更多位点共享。记录到9目16科20属18种鸟类，90%的鸟类OTUs出现在三个或更少的位点。采样到12个两栖动物OTUs，属于1目6科7属7种。75%的两栖动物物种仅限于三个或更少的点位。记录了9目15科27属20种哺乳动物。站点RS8和RS4的哺乳动物丰富度最高。
3.3 受威胁/外来物种
通过eDNA宏条形码鉴定的62种脊椎动物中，90%被列为“无危”物种。但也记录到具有一定威胁程度的物种，例如被世界自然保护联盟列为“近危”但在米纳斯吉拉斯州被视为“易危”的毛鼻水獭。鱼类霍氏孔腹鱼和食肉动物南美浣熊被列为巴西的外来入侵物种。一些已知存在于该流域的特有和濒危物种未在本研究中被记录。
4 讨论
4.1 通过eDNA解读生物多样性模式
与假设相反，森林覆盖率并非驱动物种丰富度的主要因素。相反，采矿活动压力是圣安东尼奥河流域群落组成最一致的影响因子。群落组成在流域间存在差异，并且共同响应空间和环境梯度。氧化还原电位（ORP）对脊椎动物群落表现出独立影响，是上游圣安东尼奥河流域脊椎动物丰富度的主要预测因子。ORP反映了水生系统氧化或还原化学物质的能力，高ORP通常与更好的水质相关。本研究首次建立了ORP与鱼类及其他脊椎动物丰富度的关系。
研究发现圣安东尼奥克鲁塞罗溪坡地的群落与佩希河坡地的群落明显不同，西坡的脊椎动物丰富度更高。下游主河道站点（如RS8/RS4）的较高多样性符合河流连续体概念（RCC）的预期。然而，物种周转而非纯粹的嵌套性主导了群落组成的变化，表明在RCC梯度之上，局部环境过滤和人为压力进一步筛选物种，在不同位点产生了不同的组合。
4.2 eDNA与多营养级生物多样性
圣安东尼奥河流域仅占多西河流域总面积的13%，但拥有多西河最多的本地鱼类物种丰富度，被认为是保护鱼类多样性的优先区域。本研究检测到的鱼类科组成与传统采样结果一致。两栖动物的代表性有限，可能与采样季节有关。鸟类多样性较高，但爬行动物未被检测到，可能与eDNA释放量少、种群密度低以及所用引物非针对该类群优化有关。
4.3 具有保护重要性的物种
利用短DNA片段进行有效物种鉴定需要可靠的已知分类群参考序列库。参考数据库的缺乏是eDNA宏条形码应用的局限性之一，新热带动物区系的参考数据库通常不完整。参考数据库中缺乏新热带多样性代表序列可能是许多OTU无法鉴定到物种水平的原因之一。此外，需要开发能够充分识别和区分高度多样性热带类群物种的分子标记。建立条形码库、标准化采集协议和开发针对热带动物区系的特异性标记对于增强认知和支持保护至关重要。
4.4 保护意义
气候变化、森林砍伐、景观破碎化及其他人为威胁正在持续减少全球脊椎动物种群。本研究通过eDNA宏条形码技术，快速清查了圣安东尼奥河流域一小片离散区域的脊椎动物生物多样性及其驱动因素。快速测绘有助于应对在物种消失前进行编目的挑战。
群落在该流域的东西坡表现出明显的分类学和环境差异。物种周转是这些群落变异的重要因素。建议该地区的管理和保护策略应考虑对两个坡地采取不同的方法，并鉴于圣安东尼奥河流域的高度异质性，优先保护多种栖息地。
圣安东尼奥河流域作为多西河流域最大的保存完好的残留地之一，其生物多样性本底数据的建立至关重要。这些发现强调了圣安东尼奥河流域作为生物多样性避难所的重要性，并为保护、恢复和环境监测策略提供了宝贵的见解。
