卵形孢螺菌中细胞色素c含周质硝酸盐还原酶的发现及其在能量守恒中的作用

《Environmental Microbiology》：A Cytochrome c-Containing Periplasmic Nitrate Reductase in the Acetogen Sporomusa ovata

本研究发现卵形孢螺菌（Sporomusa ovata）通过含有细胞色素c的周质硝酸盐还原酶（Nap）和亚硝酸盐还原酶（Nrf）将硝酸盐还原为铵，这一过程涉及膜结合的电子传递链并可能偶联能量守恒。研究通过基因组学、转录组学和酶学分析证实，硝酸盐的存在显著上调了硝酸盐还原岛基因的表达，并揭示了该菌在异养和自养条件下优先利用硝酸盐作为电子受体的生理特性，为理解含细胞色素乙酰生成菌的能量代谢机制提供了新见解。

　　

卵形孢螺菌（Sporomusa ovata）是一种罕见的含有细胞色素和醌的乙酰生成细菌，其能够利用二氧化碳（CO₂）作为电子受体通过Wood-Ljungdahl途径（WLP）还原生成乙酸，并在此过程中实现能量守恒。然而，该菌中细胞色素和醌的功能以及其对替代电子受体（如硝酸盐）的利用机制长期以来尚不明确。本研究通过生理学、基因组学、转录组学和生物化学方法，系统揭示了S. ovata中硝酸盐还原的途径及其在能量代谢中的重要作用。

硝酸盐促进生长并改变乙酸生成

在异养生长条件下（以果糖为电子供体），硝酸盐的存在使S. ovata的最终光密度（OD₆₀₀）从3.1增加至3.5，倍增时间从4小时缩短至3.7小时。乙酸产量从45.4 mM降至30.2 mM，乙酸/果糖比率从2.4降至1.6，同时15.6 mM硝酸盐被消耗。在CO₂限制条件下，硝酸盐的添加同样提高了菌体密度并减少了乙酸生成，且避免了乳酸和乙醇等副产物的积累。在自养条件下（以H₂为电子供体），硝酸盐使倍增时间从17.3小时缩短至12.2小时，最终OD₆₀₀增加246%。值得注意的是，在自养条件下，硝酸盐和CO₂被同时用作电子受体，电子分布比率约为1:1.2。静息细胞实验进一步证实，在异养条件下，硝酸盐优先于CO₂被用作电子受体，Wood-Ljungdahl途径的活性受到抑制。

基因组中的硝酸盐还原岛

对S. ovata基因组（登录号：CP146301）的分析发现了一个硝酸盐还原岛，其GC含量（53.7%）显著高于基因组平均水平（43.5%），提示该区域可能通过水平基因转移获得。该岛包含编码周质硝酸盐还原酶（Nap）的基因簇（napGHCAD），其中napA编码催化亚基（含钼蝶呤辅因子），napGH和napC编码负责从醌池（Q-pool）传递电子的醌脱氢酶复合物。下游基因编码细胞色素c和血红素生物合成蛋白、周质亚硝酸盐还原酶（NrfH1A1）以及一个杂化簇蛋白（Hcp1）。NrfA1与NrfH1可能形成膜结合复合物，催化亚硝酸盐的六电子还原生成铵。

硝酸盐诱导的转录组变化

转录组分析显示，与仅以果糖培养的细胞相比，硝酸盐存在下共有1662个基因差异表达（670个上调，992个下调）。硝酸盐还原岛上的所有nap基因（napGHCAD）均显著上调（log2FC +9.46至+11.47），nrfHA1基因（log2FC +4.94至+5.47）及细胞色素c和血红素生物合成相关基因（log2FC +3.45至+6.32）也明显上调。hcp1基因表达量大幅增加（log2FC +9.16）。此外，一个推测的硝酸盐/亚硝酸盐ABC转运系统（SOV_08090-08110）也被上调。值得注意的是，Wood-Ljungdahl途径、Rnf复合物、ATP合酶等中心碳代谢和能量守恒相关基因的表达未受硝酸盐影响。

膜结合的硝酸盐和亚硝酸盐还原酶活性

酶活测定证实，硝酸盐诱导生长的细胞其细胞提取物具有膜结合的硝酸盐和亚硝酸盐还原酶活性。以还原型甲基紫精（MV）为电子供体时，膜组分中硝酸盐还原酶的比活（5.3 U mg^-1）是胞质组分（0.48 U mg^-1）的11倍，总活性的64%位于膜上。亚硝酸盐还原酶活性也主要位于膜组分（比活3.4 U mg^-1，占总活性73%）。当使用还原型醌类似物AQDS作为电子供体时，硝酸盐和亚硝酸盐还原酶活性仅存在于膜组分中，表明醌池是这些酶的直接电子供体。羟胺还原酶活性也被检测到，推测由亚硝酸盐还原酶催化。这些酶活性仅在硝酸盐诱导的细胞中被检测到。

细胞色素的检测

血红素过氧化物酶染色显示，在硝酸盐生长的细胞膜组分中存在分子量约为45 kDa、25 kDa和17 kDa的含血红素蛋白条带。这些条带可能与NrfA1（47.8 kDa）、NrfH1（17.0 kDa）以及NapC（19.8 kDa）相对应，证实了细胞色素在硝酸盐还原途径中的参与。

硝酸盐作为氮源

在缺乏铵盐的最小培养基中，硝酸盐的添加能够恢复S. ovata的生长缺陷，使其生长达到与添加氯化铵相当的水平，表明硝酸盐也可作为该菌的氮源。基因组中未发现编码同化型硝酸盐还原酶的第二个基因簇。

讨论：硝酸盐还原模型与能量守恒意义

本研究提出S. ovata中硝酸盐还原至铵的模型：电子从醌池通过NapGH和NapC传递至周质硝酸盐还原酶NapA，将硝酸盐还原为亚硝酸盐；随后，亚硝酸盐由周质细胞色素c含亚硝酸盐还原酶NrfA1（与NrfH1形成复合物）进一步还原为铵。Hcp1可能用于解毒反应过程中可能产生的NO。该膜结合电子传递链可能通过周质氢酶氧化H₂产生标量质子，以及硝酸盐/亚硝酸盐还原过程中消耗质子，共同建立跨膜电化学梯度（ΔpH和Δψ），进而驱动ATP合成。这与缺乏细胞色素的乙酰生成菌（如Clostridium ljungdahlii）利用可溶性、非能量守恒的硝酸盐还原酶机制形成鲜明对比。

研究表明，硝酸盐还原在S. ovata中是一个受精细调控的过程，其作为优先电子受体影响碳和电子流向，并与基础能量代谢途径存在互动。硝酸盐还原岛的独立GC含量暗示其可能通过水平基因转移获得，这解释了不同乙酰生成菌中硝酸盐还原途径的多样性。这项工作深化了我们对含细胞色素乙酰生成菌能量代谢多样性的理解，揭示了膜结合电子传递链在厌氧细菌环境适应中的重要作用。