热泉中Aquificales与Thermus的碳氮互养：驱动微生物群落组装的代谢互作

《Environmental Microbiology》：Cross-Feeding of Carbon and Nitrogen Between Aquificales and Thermus in Hot Springs

本文揭示了黄石公园与冰岛热泉中Aquificales（泉古菌目）与Thermus（嗜热菌属）的共分布模式，其核心在于自养且固氮的Aquificales通过交叉喂养（Cross-Feeding）为异养的Thermus提供固定碳（如有机酸）和固定氮（如氨基酸），从而在贫营养（低DOC、低NH3/NH4+）热泉生态系统中维持群落生物多样性及功能。该研究通过宏基因组学与共培养实验验证了二者间的代谢互作，凸显了Aquificales在热泉生态系统中的基石作用。

　　

引言

高温热泉微生物群落中碳和氮的获取与循环机制尚未被完全阐明。本研究通过对黄石国家公园（YNP）和冰岛105个高温热泉群落的宏基因组分析，发现推定为自养和/或固氮的泉古菌目（Aquificales）与嗜热菌属（Thermus）种群存在共分布模式。针对冰岛一处热泉中自养和固氮种群的有针对性富集，获得了一株能够编码二氧化碳和氮固定途径的潘皮尼弗文斯菌（Pampinifervens，属于Aquificales）与一株嗜热菌（Thermus）的共培养物。生长实验表明，潘皮尼弗文斯菌可以支持嗜热菌对固定碳和氮的需求，促进其生长。

材料与方法

样品采集与地球化学分析

从冰岛36个热泉和YNP的58个热泉（部分泉点多次采样）采集了沉积物和/或浮游生物样品。测量了泉水的pH、温度、电导率、溶解氧（DO）等参数，并汇编了已发表的泉水溶解有机碳（DOC）和氨/铵（NH₃/NH₄⁺）浓度数据。

DNA提取与宏基因组分析

使用商业试剂盒从沉积物样品中提取基因组DNA，并通过Illumina NovaSeq平台进行测序。对测序数据进行组装、分箱，获得了与泉古菌目和嗜热菌属相关的宏基因组组装基因组（MAGs）。利用KEGG数据库和METABOLIC软件筛选与碳固定（泉古菌目：还原性三羧酸循环，rTCA；嗜热菌：卡尔文循环，Calvin cycle）和固氮（钼氮酶，NifHDK）相关的编码基因。

系统基因组学与功能注释

从NCBI数据库获取泉古菌目和嗜热菌属的代表性基因组和MAGs，使用30个通用标记基因构建系统发育树，评估不同地理来源菌株的亲缘关系。

富集培养与分离

选择冰岛Flúeir 5号泉（Flu05）的沉积物进行富集培养。使用成分为CaCl₂、KCl、MgCl₂、Na₂SO₄的无机盐培养基，气相组成为58% N₂、20% CO₂、20% H₂、2% O₂（体积比），在80°C、50 rpm条件下培养，旨在富集自养固氮微生物。通过稀释法获得稳定共培养物，并对其中的微生物进行分离。使用嗜热菌培养基（含硝酸盐和乙酸钠）成功分离出嗜热菌。

营养交叉喂养实验

在自养（CO₂为碳源，H₂为电子供体，O₂为电子受体）条件下，设置固氮（N₂为氮源）和非固氮（添加NH₄Cl为氮源）两组实验，研究共培养物中潘皮尼弗文斯菌与嗜热菌的生长动态。通过荧光显微镜计数和针对两种微生物16S rRNA基因的特异性qPCR引物，定量监测种群丰度变化。

嗜热菌分离株生长实验

使用分离得到的嗜热菌纯培养，测试其在不同氮源（氯化铵、谷氨酸、酪蛋白氨基酸）下的生长情况，以评估其氮源偏好性。同时，测试其在自养固氮或自养但提供固定氮源条件下的独立生长能力。

结果与讨论

泉古菌目与嗜热菌的共分布

宏基因组和16S rRNA基因扩增子序列数据表明，泉古菌目和嗜热菌在全球的中性至碱性热泉的水体和水生沉积物群落中频繁共现。在分析的105个群落中，有65个含有泉古菌目相关的MAGs，包括Hydrogenobaculum、Sulfurihydrogenibium、Hydrogenobacter、Thermocrinis和Pampinifervens等属。嗜热菌相关的MAGs在34个宏基因组中被识别。在含有嗜热菌的34个泉点中，有29个同时存在泉古菌目，显示出强烈的共分布模式。这种分布受pH和温度影响，例如Hydrogenobaculum多见于较低温的酸性泉，而Thermocrinis则多见于较高温的中性至碱性泉。冰岛和YNP的泉古菌目及嗜热菌种群在系统发育上形成明显的地理分支，表明存在地域性分化。

YNP与冰岛热泉的地球化学差异

YNP热泉系统主要位于流纹岩基岩中，而冰岛热泉系统主要位于玄武岩基岩中，这种地质构造差异影响了泉水化学性质。YNP热泉的DOC浓度（最高24.8 ppm）和溶解氨浓度（最高69.1 ppm）普遍高于冰岛热泉（DOC最高2.4 ppm，溶解氨最高1.09 ppm）。特别是冰岛的中性至碱性泉，其DOC和溶解氨含量极低，这可能更强烈地选择具有自养和固氮能力的微生物。

泉古菌目与嗜热菌相关MAGs的代谢差异

超过70%的泉古菌目MAGs编码rTCA循环的碳固定途径，超过50%的嗜热菌MAGs编码卡尔文循环的碳固定途径，两地之间无显著差异。在固氮潜力方面，所有嗜热菌MAGs均未编码固氮酶（Nif）同源基因。而在泉古菌目中，冰岛泉点的MAGs编码Nif的比例远高于YNP泉点。在冰岛，75%的Hydrogenobaculum MAGs、50%的Hydrogenobacter MAGs、24%的Thermocrinis MAGs和67%的Pampinifervens MAGs编码Nif同源基因；而在YNP，仅在酸性泉的Hydrogenobaculum MAGs中检测到Nif。这表明在营养更为匮乏的冰岛热泉中，固氮泉古菌目更为普遍。

潘皮尼弗文斯菌与嗜热菌的共培养及代谢分析

从冰岛Flu05泉（pH 7.6, 84.4°C）成功富集到一个包含两株潘皮尼弗文斯菌（Bin 1和Bin 3）和一株嗜热菌（Bin 2，与Thermus antranikianii相似度98.4% ANI）的稳定共培养物。基因组分析显示，优势潘皮尼弗文斯菌（Bin 1）编码完整的rTCA循环、[NiFe]-氢酶（用于H₂氧化）、硫氧化（Sox）系统、反硝化途径以及固氮酶（NifHDK）系统，具备自养、固氮、利用H₂或硫化合物作为能源的能力。嗜热菌（Bin 2）编码糖酵解、TCA循环、氧化磷酸化途径，也编码了卡尔文循环和部分硫氧化（Sox）途径，提示其具有潜在的自养能力，但它缺乏固氮酶基因，需要外源固定氮。

非固氮自养条件下的交叉喂养

在提供NH₄Cl（非固氮条件）、CO₂、H₂/O₂的条件下，共培养物生长良好，总细胞浓度在36小时内增长近3个数量级。qPCR结果显示，在生长前期（12-24小时），潘皮尼弗文斯菌的16S rRNA基因模板数迅速增加，而嗜热菌的增长缓慢，表明嗜热菌的生长依赖于潘皮尼弗文斯菌提供的固定碳。

固氮自养条件下的交叉喂养

在以N₂为唯一氮源、CO₂为碳源、H₂/O₂为能源的固氮条件下，共培养物的总细胞产率低于非固氮条件，反映了固氮过程的高能量需求。生长动态显示，在培养前6小时，潘皮尼弗文斯菌种群首先增长，而嗜热菌种群略有下降；在6至24小时期间，潘皮尼弗文斯菌种群略有下降，而嗜热菌种群开始缓慢但持续增长。特别值得注意的是，在固氮条件下共培养24小时后，嗜热菌的16S rRNA基因模板数显著高于非固氮条件下的最终值。这表明嗜热菌在潘皮尼弗文斯菌同时进行碳、氮固定的条件下生长得更好。

嗜热菌对氮源的偏好

使用分离的嗜热菌纯培养进行的实验表明，当提供谷氨酸或酪蛋白氨基酸作为氮源时，嗜热菌的生长速率和最终细胞密度均显著高于以氨（NH₄Cl）作为氮源的情况。这为共培养实验中观察到的现象提供了合理解释：嗜热菌可能更偏好利用潘皮尼弗文斯菌固氮后产生的有机氮化合物（如氨基酸），而非直接利用氨。此外，分离的嗜热菌在缺乏有机碳源和能源（仅提供CO₂、H₂、O₂）的条件下无法独立生长，无论氮源是N₂还是NH₄Cl，这证实了其在共培养中对潘皮尼弗文斯菌提供的固定碳的依赖性。

结论

本研究揭示了Aquificales和Thermus在高温热泉中的共分布模式源于它们之间密切的代谢互作，特别是自养且固氮的Aquificales向异养且依赖外源氮的Thermus交叉喂养固定碳和氮。在溶解有机碳和固定氮极度匮乏的冰岛热泉中，这种互作关系尤为关键。嗜热菌对有机氮（如氨基酸）的偏好可能进一步强化了这种共生关系。这些发现阐明了微生物代谢互作在驱动高温环境群落组装和维持生物多样性中的根本作用，凸显了Aquificales作为初级生产者在热泉生态系统中的基石地位。未来的研究需要进一步鉴定交叉喂养的具体代谢物，并探究互作关系对更大尺度生态系统功能的影响。