《Environmental Microbiology》：Dynamics and Eco-Genomics of Baltic Sea Nitrifiers: Seasonality, Niches, Interactions and Genomic Uniqueness
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本文通过宏基因组学和rRNA基因测序技术，系统揭示了波罗的海硝化微生物（包括氨氧化古菌AOA、氨氧化细菌AOB和亚硝酸盐氧化细菌NOB）的时空动态和基因组多样性。研究发现硝化微生物在无光层水体中持续丰富，并呈现垂直生态位分化；在晚秋至早春的表层水体中出现季节性高峰，其丰度与亚硝酸盐（NO2?）、硝酸盐（NO3?）呈正相关，与太阳辐射和叶绿素a呈负相关。研究通过选择性富集获得了5个新型AOA基因组（包括优势深水类群），比较基因组学显示其核心基因高度保守，变异主要存在于与环境互作及氮磷代谢相关基因。该研究为理解波罗的海硝化微生物的生态位提供了新见解，并初步探索了其生态模式的机制与功能意义。
1 引言
硝化作用是微生物将还原态氮底物氧化为硝酸盐（NO3?）的过程，在海洋生态系统的氮循环中起关键作用。该过程主要由氨氧化古菌（AOA）、氨氧化细菌（AOB）和亚硝酸盐氧化细菌（NOB）驱动。波罗的海作为全球最大的半咸水盆地之一，具有显著的盐度、氧气、营养盐梯度及强烈的季节性变化，为研究硝化微生物的生态和进化驱动因素提供了理想模型环境。
2 实验方法
2.1 样品采集
研究在波罗的海进行了大规模时空采样，包括基尔峡湾（Kiel Fjord）的每周两次时间序列采样（2021年10月至2023年5月）以及博克尼斯埃克（Boknis Eck）站点的月度深度积分采样（1–25米）。营养盐浓度通过连续流动分析仪测定，叶绿素a通过荧光法检测。
2.2 过滤、DNA提取与测序
海水样品经0.2微米滤膜过滤后，使用植物DNA提取试剂盒进行DNA提取。扩增子测序采用通用引物515F/926R靶向V4-V5区；宏基因组测序采用Hackflex建库法，在Illumina NovaSeq平台上进行。
2.3 AOA的选择性富集与测序
通过添加铵盐（100 μmol/L）和抗生素（氨苄青霉素、链霉素等）的选择性培养基，从波罗的海水样中富集AOA。在硝酸盐积累>70 μmol/L时进行传代，并通过宏基因组测序获得高质量基因组。
2.4 扩增子与宏基因组数据处理
使用QIIME2和DADA2处理扩增子数据，获得扩增子序列变异（ASV）。宏基因组数据经SPAdes组装后，通过Anvi’o和CheckM进行基因组分箱和质量评估。
2.5 16S rRNA基因系统发育与宏基因组分型
从宏基因组中提取16S rRNA基因读数，通过系统发育树分析（EPA-ng）对硝化微生物进行分型，重点分析Nitrosopumilus、Nitrospinaceae、Nitrospiraceae等类群。
2.6 AOA的比较基因组学与泛基因组学分析
从GTDB数据库获取60个Nitrosopumilus代表基因组，通过GToTree构建系统发育树，并基于核心基因进行功能注释。通过泛基因组分析将基因簇分为核心、半核心、灵活和稀有四类。
2.7 环境数据的统计分析
使用eLSA计算硝化微生物ASV与环境参数（如温度、营养盐、叶绿素a）的时滞相关性，并通过Cytoscape构建相关性网络。
3 结果
3.1 硝化微生物的流域尺度分布
硝化微生物在波罗的海无光层（≥25米）水体中持续存在，其中Nitrosopumilaceae相对丰度最高（0.53%），其次为Nitrosomonadaceae和Nitrospinaceae（各0.12%）。在光层（<25米），硝化微生物的检出率较低（AOA为24%），且以Nitrosopumilus limneticus相关类群为主（97%）；无光层则呈现更混合的AOA群落，包括与Nitrosopumilus oxyclinae相关的类群。
3.2 硝化微生物的季节性动态与环境参数关联
时间序列分析显示，AOA和NOB在基尔峡湾表层水体中具有显著的季节性变化，丰度在晚秋至冬季达到峰值，与硝酸盐、亚硝酸盐浓度正相关，与太阳辐射、叶绿素a负相关。AOB的季节性模式较为平缓，但不同ASV存在演替现象。
3.3 选择性富集与AOA基因组特征
通过选择性富集，研究获得了5个新型Nitrosopumilus基因组，包括优势深水类群Ca. Nitrosopumilus balticoprofundus。比较基因组学显示，AOA基因组在氨氧化和碳固定相关基因为核心保守功能，而与环境互作相关的基因（如紫外修复、运动性、磷转运）存在较大变异。泛基因组分析表明，约75%的基因为核心或半核心基因，灵活基因多富集于信号转导、细胞膜合成等途径。
4 讨论
本研究通过整合高通量测序、时间序列数据和基因组学，揭示了波罗的海硝化微生物的生态位分化和季节性动态。AOA在冬季表层水体的增殖可能源于低光条件下光抑制减弱和底物竞争减少。基因组水平的变异提示，硝化微生物的环境适应性可能通过水平基因转移实现，而非严格的系统发育保守性。未来需结合宏转录组学、蛋白质组学等技术，进一步揭示其生理生态机制。
5 结论
本研究系统刻画了波罗的海硝化微生物的时空分布格局，并成功富集获得多个新型AOA基因组。结果表明，硝化微生物的群落结构受环境因子（如光照、营养盐）的强烈调控，且基因组功能多样性可能与其生态位适应性密切相关。该研究为理解全球变化背景下海洋氮循环微生物的响应机制提供了重要理论基础。
