基于供体-受体共轭的共价三嗪骨架的“开-关-开”电化学发光适配体传感器的构建，用于高效检测赭曲霉毒素A

《Microchemical Journal》：Construction of a signal “on-off-on” electrochemiluminescence aptasensor based on donor-acceptor conjugated covalent-triazine frameworks for efficient detection of ochratoxin A

高效电化学发光aptasensor通过共价三嗪框架与双模淬灭机制实现麦角毒素A的精准检测。摘要：

　　

Fenghe Duan|Qingmei Xing|Yifei Wang|Zhenzhen Li|Chuanpan Guo|Shuai Zhang|Bin Hu|Zhihong Zhang

河南工程学院材料工程学院纤维制备与改性工程技术研究中心，中国郑州451191

摘要

本研究开发了一种新型的“开-关-开”电化学发光（ECL）适配体传感器，用于食品中赭曲霉毒素A（OTA）的灵敏选择检测。该传感器结合了竞争性适配体检测策略和双模态淬灭机制。一种供体-受体（D-A）共轭的三嗪框架（CTF）通过Schiff碱溶热法合成，使用4,4′,4″-(1,3,5-三嗪-2,4,6-三基)三[苯甲醛]和2,2′-联吡啶-5,5′-二胺（记为TFPT-BPY-CTF），既作为高性能的ECL发射体（与K₂S₂O₈配合使用），也作为生物平台来固定与OTA适配体互补的单链DNA（ssDNA）。为了提高电子转移效率，适配体探针被修饰为含有Mn_xFe_yO_z的复合物，其中MnFe₂O₄、α-MnO₂和Fe₂O₃混合使用。随后，通过形成适配体/ssDNA双链，将Apt/Mn_xFe_yO_z复合物成功沉积在ssDNA/TFPT-BPY-CTF表面上。这种配置通过能量共振转移和电子转移的双模机制有效淬灭了D-A TFPT-BPY-CTF的强ECL信号。然而，当引入OTA时，OTA与适配体形成的G-四链结构导致Apt/Mn_xFe_yO_z探针解离，从而使ECL信号得以恢复。最终，使用基于TFPT-BPY-CTF的ECL适配体传感器实现了OTA的超灵敏检测。所构建的ECL适配体传感器不仅表现出从1.0?pg?mL^?1到100?ng?mL^?1的宽线性范围和0.21?pg?mL^?1

引言

霉菌毒素是农产品和植物源性食品中真菌产生的次级代谢产物，通过摄入、吸入或皮肤接触可能对人类和动物造成严重危害[1]。在多种霉菌毒素中，如黄曲霉毒素B（AFB）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和展青霉素，OTA能够污染多种食品，如玉米、小麦、牛奶、谷物、葡萄汁、啤酒和咖啡[2]。高浓度OTA的摄入会导致一系列严重后果，如蛋白质合成受阻、代谢途径紊乱、钙平衡失调以及人类和动物的DNA损伤[3]。因此，许多国家和地区对OTA的最大允许含量制定了法规。例如，欧盟委员会规定了谷物（5?μg?kg^?1）、烘焙咖啡（5?μg?kg^?1）、干果（10?μg?kg^{?1?1?1，而谷物和咖啡产品的最大允许含量为5?μg?kg?1[5,6]。世界卫生组织表示，人体每周摄入100?ng?kg?1的OTA是可容忍的[7]。因此，快速灵敏地检测OTA对于确保食品安全和人们的生活安全至关重要。已经使用了多种传统方法来测定食品样品中的OTA，如色谱和光谱方法（如超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS）、LC-MS、LC-荧光检测器-MS、HPLC、表面增强拉曼散射、色谱免疫传感策略、比色传感、酶联免疫吸附测定（ELISA）等）。尽管在OTA分析方面投入了大量努力，但由于现有方法的局限性（如耗时长、仪器成本高、选择性和灵敏度低以及需要专业技术人员），高效测定OTA仍然是一个亟待解决的问题。为了解决这个问题，开发了多种先进的传感方法，结合生物传感策略来高效监测农产品和植物源性食品中的OTA，如荧光[8]、比色[9]、电化学[10]、光电化学[11]和电化学发光（ECL）[12]。其中，ECL生物传感技术结合了电化学和化学发光的特点，在各个领域得到广泛应用，因其具有成本效益高、操作简单、灵敏度高和线性范围广等优点[13]。已经制造并使用了多种ECL生物传感器来检测食品中的各种霉菌毒素（如OTA、展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和AFB1），使用抗体或适配体作为识别探针[14]。与使用抗体作为信号识别探针的ECL免疫传感器相比，使用适配体链作为探针的ECL适配体显示出更高的灵敏度、更低的成本、更高的可行性和更快的响应速度[15]。然而，在开发用于直接检测OTA的ECL适配体时，常常观察到灵敏度不足和准确性较低的问题，因为霉菌毒素的分子量低和浓度低无法引起输出信号的明显变化[16]。因此，已经开发了多种信号放大策略来提高ECL适配体对OTA的检测效率，如基于电子转移的放大、共振能量转移（RET）放大以及基于DNA技术和纳米材料的放大[17]。其中，ECL-RET机制经常被用来构建高性能的ECL适配体，用于灵敏精确地分析霉菌毒素，因为它不需要激发光源，可以在相对较长的距离上传递能量，并且比传统的F?rster效应、生物发光和化学发光RET具有更高的可行性[18]。为此，需要一个能量供体-受体（D-A）系统，通过长距离的偶极-偶极相互作用将能量从激发态供体传递给附近的基态受体[19]。供体具有高发射强度，而受体则通过RET改变发射强度。迄今为止，只有少数D-A对被用于开发检测霉菌毒素的ECL生物传感器，如硫化镉半导体量子点（D）和Cy5-DNA（A）、Ru@SiO₂（D）和亚甲蓝（A）[20]，以及PCN-222（D）和金纳米颗粒改性的氧化石墨烯（A）[21]。值得注意的是，使用荧光标记的DNA或贵金属会增加所开发ECL生物传感器的成本。因此，寻找具有高ECL发射能力的纳米材料作为供体对于通过ECL-RET机制增强ECL适配体的输出信号和检测灵敏度至关重要。}

最近，共价有机框架（COFs）作为一种多孔结晶有机框架，通过连接有机构建单元合成，由于其独特的性质（如大表面积、有序通道和预先设计的结构）被广泛用于食品污染物的分析[22]。目前，已经使用了几种类型的COFs通过不同技术直接分析OTA[[23], [24], [25]]，但关于基于COFs的OTA适配体开发的报道很少。由于设计功能性模块可以调节长程有序COFs的电荷转移行为，因此可以有效激活ECL发射[26]。特别是，通过拓扑模板化共轭将电子供体和受体单元整合到网状骨架中，可以通过内部电荷转移显著提高ECL发射性能[27]。不幸的是，由于π-π堆叠相互作用和旋转不稳定的连接（如COFs中的亚胺键）之间的持续权衡，开发具有高ECL响应的COFs仍然是一个主要挑战[26,28]。在不同类型的COFs中，共价三嗪框架（CTFs）通过环状三聚化或羟醛缩合反应合成，通常表现出高稳定性和有前景的ECL性能，因为它们的化学结构和管理良好的D-A对[29]。基于上述讨论，构建一种新型含三嗪的COF基ECL适配体对于使用RET策略高效分析食品中的OTA非常重要。

在这项工作中，采用了一种新设计的“开-关-开”信号生物传感策略，基于新型的D-A CTF来制造ECL适配体，用于精确检测食品中的OTA。如图1所示，D-A CTF通过4,4′,4″-(1,3,5-三嗪-2,4,6-三基)三[苯甲醛]（TFPT）和2,2′-联吡啶-5,5′-二胺（BPY）（记为TFPT-BPY-CTF）的Schiff碱溶热反应获得，同时用作ECL发射体，并作为固定与OTA靶向适配体互补的信号链DNA（ssDNA）的生物平台。TFPT-BPY-CTF的D-A共轭结构提供了可调的局部电荷分布和高电荷转移效率，在K₂S₂O₈存在下增强了ECL发射。用Mn_xFe_yO_z氧化物修饰的OTA靶向适配体与固定在TFPT-BPY-CTF修饰的玻璃碳电极（TFPT-BPY-CTF/GCE）上的ssDNA杂交，形成适配体/ssDNA双链。这种配置通过RET和电子转移的协同效应有效淬灭了TFPT-BPY-CTF的强ECL信号。最终，在检测OTA时，OTA与Mn_xFe_yO_z标记的适配体形成的G-四链导致DNA双链从TFPT-BPY-CTF/GCE表面解离，从而使ECL信号得以恢复。因此，通过制造的基于TFPT-BPY-CTF的“开-关-开”ECL适配体实现了OTA的精确灵敏检测。与其他类型的OTA适配体相比，所提出的基于TFPT-BPY-CTF的ECL适配体在灵敏度、选择性和实用性方面表现出创新点，因为其ECL发射能力增强、电子转移速度快、共轭度高、比表面积大和功能优异。

实验部分

其他实验细节在支持信息中提供，包括化学品和材料、基本表征、所有溶液的制备、Mn_xFe_yO_z的合成以及Apt/Mn_xFe_yO_z复合物的制备，以及ECL和电化学测量。

TFPT-BPY-CTF的基本表征

TFPT-BPY-CTF含有丰富的三嗪基团和π电子系统，有利于提高其光电性能[29]。如图S2a所示，TFPT-BPY-CTF的扫描电子显微镜（SEM）图像显示由堆叠的片状结构和碎片组成的不规则块状结构。透射电子显微镜（TEM）图像（图1b）证实了这一观察结果，显示了形状各异的聚集纳米片。

结论

总结来说，开发了一种新型的“开-关-开”信号ECL适配体，使用CTF作为高效的ECL发射体，结合了双模态淬灭效应和竞争性适配体检测策略。得益于TFPT和BPY反应合成的CTF的独特特性，如窄带隙、光诱导电子和空穴的分离增强以及D-A共轭结构，它作为优秀的ECL发射体表现出色。

CRediT作者贡献声明

Fenghe Duan：撰写——原始草稿，概念构思。Qingmei Xing：形式分析，调查。Yifei Wang：数据管理，软件。Zhenzhen Li：方法学，软件。Chuanpan Guo：资源，验证。Shuai Zhang：监督，可视化。Bin Hu：资金获取，撰写——审稿与编辑。Zhihong Zhang：撰写——审稿与编辑，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了河南省自然科学基金（编号252300420760, 252300421534）、中原科技创新领军人才（编号254200510025）和河南省科技创新团队计划（编号25IRTSTHN003）的支持。