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本文报道了CRISPR-Cas系统家族新成员——Cas12a3，其被靶RNA激活后可特异性切割tRNA的3′端CCA尾部，介导独特的抗噬菌体免疫反应。该研究通过生化和结构分析揭示了Cas12a3的tRNA装载域（tRLD）精准定位底物的机制，并开发了基于此特性的多重RNA检测新工具，为CRISPR工具箱拓展了全新方向。
Cas12a3和Cas12a4可实现无DNA损伤的生长停滞
研究人员通过系统发育分析发现，在Cas12a2附近存在两个新的核酸酶分支，分别命名为Cas12a3和Cas12a4。大多数这些核酸酶与CRISPR阵列以及间隔区获取基因cas1、cas2和cas4相关。与可广泛切割DNA的Cas12a2不同，Cas12a3和Cas12a4缺乏芳香钳区域的关键残基。在大肠杆菌中进行的功能实验表明，Cas12a3和Cas12a4在靶RNA激活后能介导生长停滞和噬菌体防御，但不会诱导SOS DNA损伤反应，这表明它们通过一种不同于Cas12a2的独特机制发挥免疫功能。
活性Cas12a3和Cas12a4切割RNA而非DNA
为了探究Cas12a3和Cas12a4的底物偏好性，研究人员使用了随机序列的RNA、单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）底物库进行体外切割实验。结果显示，与Cas12a2激活后非特异性切割所有核酸底物不同，Cas12a3和Cas12a4在靶RNA激活后，仅特异性切割RNA底物库。值得注意的是，Cas12a3对其靶RNA的切割并不完全，暗示其可能存在更偏好的特异性RNA底物。
Cas12a3偏好切割特定RNA底物
在无细胞转录翻译系统（TXTL）中的实验进一步揭示了Cas12a3的作用模式。当激活的Cas12a3在报告质粒加入前预先孵育于TXTL系统中时，能够完全抑制后续GFP报告基因的表达，而Cas12a2则无此效果。这表明Cas12a3可能通过降解对基因表达至关重要的RNA组分（如tRNA或rRNA）来发挥作用，而非直接切割靶标转录本。
Cas12a3切割tRNA尾部
为了直接鉴定Cas12a3的生理性RNA底物，研究人员对TXTL反应后的RNA进行了纳米孔直接RNA测序。分析结果发现，激活的Cas12a3并未显著切割rRNA或靶RNA，而是特异性地切割了多种tRNA的3′端，切割位点通常位于保守的3′ CCA尾部上游2-4个核苷酸处。Northern印迹分析证实了特定tRNA的切割。使用纯化的大肠杆菌总tRNA进行的体外实验表明，Cas12a3可切割几乎所有的tRNA，主要发生在tRNA 3′末端上游三到五个核苷酸的位置。即使tRNA带有氨基酸或化学修饰，Cas12a3依然能够有效切割。与之相比，Cas12a4则表现出不同的tRNA切割模式。这些结果表明，激活的Cas12a3核酸酶优先切割tRNA的3′尾部，同时保留结合的靶RNA，从而将其与Cas12a2和Cas12a4区分开来。
研究人员还将Cas12a3与已知可切割tRNA反密码子环的LshCas13a进行了比较。虽然两者在TXTL中都能有效抑制GFP表达，但RT-qPCR显示只有LshCas13a会切割gfp转录本，而Cas12a3不切割靶RNA，进一步突出了其作用机制的差异性。此外，实验表明Cas12a3介导的免疫防御不依赖于RelA介导的严谨反应，其生长停滞可能源于翻译的直接中断或由tRNA切割产物诱导的其他应激反应。
tRNA通过装载域进行定位
通过微量热泳动技术证实，纯化的Ba1Cas12a3能强烈结合crRNA、靶RNA以及激活后的tRNA。利用单颗粒冷冻电镜技术，研究人员解析了Ba1Cas12a3与crRNA、靶RNA和tRNAAla(UGC)形成的四元复合物结构，分辨率达到3.1 ?。结构显示，Ba1Cas12a3包含一个REC叶和一个NUC叶，其插入结构域的一部分（残基855-960）与其他已知蛋白无同源性，被命名为tRNA装载域（tRLD），该结构域直接与tRNA相互作用。结构分析揭示了tRNA的两个关键接触点：其T臂与REC2域的一个环相互作用；而其接受茎和3′ CCA尾部则被夹在tRLD和RuvC结构域之间，使得tRNA尾部定位于RuvC核酸酶活性位点。
利用截短的tRNA底物进行的突变分析表明，tRLD以及REC2环中与T臂相互作用的残基对于tRNA的有效切割至关重要。突变tRLD中与末端腺苷堆叠的残基（如R902或N924）会显著降低tRNA切割活性。这些发现表明，Ba1Cas12a3通过REC2环和tRLD的形状特异性及电荷特异性相互作用，将tRNA的接受茎和3′ CCA尾部精准定位到RuvC活性位点，从而实现对游离tRNA的优先切割。
结构变化 enabling tRNA结合
为了深入理解Cas12a3的激活和切割机制，研究人员解析了其与crRNA结合的二元复合物、与crRNA和靶RNA结合的三元复合物以及与切割后的tRNA尾部结合的四元复合物等一系列冷冻电镜结构。这些结构揭示了Cas12a3在靶RNA识别后发生的一系列构象变化。从二元结构开始，靶RNA结合驱动Cas12a3和crRNA发生构象变化，REC2结构域移动28 ?以容纳向导-靶标双链体。在三元复合物中，tRLD虽然靠近RuvC活性位点，但灵活性增加。在切割tRNA尾部后，切割产物（5′-ACCA-3′）仍然楔在RuvC和tRLD结构域之间，使Cas12a3保持激活构象，从而可能无需构象重置即可连续捕获和切割其他tRNA。这些结构快照共同揭示了Cas12a3在靶RNA识别后，利用其独特的tRLD引导切割tRNA 3′ CCA尾部的激活路径。
Cas12a3扩展多重RNA检测能力
Cas12a3的特异性切割活性为其在多重RNA检测中的应用提供了可能。研究人员设计了一种模拟tRNA接受茎和尾部的合成报告分子（如h25），该报告分子在Cas12a3激活时能被高效切割。重要的是，Cas12a3对其报告分子的偏好性与Cas13a（偏好富含U的序列）和Cas13b（偏好富含A的序列）核酸酶正交。利用这一特性，研究人员将Cas12a3、Cas13a和Cas13b核酸酶及其各自的报告分子（标记不同荧光基团）整合到一个反应体系中，实现了对SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒（RSV）和甲型流感病毒RNA转录本的多重、一锅法检测。即使存在大量人总RNA背景，检测也不受干扰甚至有所增强。这表明Cas12a3可以很容易地与广泛使用的Cas13平台整合到多重检测方法中。
讨论
本研究报道了CRISPR-Cas系统的一个新功能分支——Cas12a3。其在crRNA引导下识别互补靶RNA后，并非直接切割靶标或非特异性降解核酸，而是特异性地切割细胞tRNA库中保守的3′ CCA尾部，从而通过破坏翻译机制诱导生长停滞并阻断噬菌体传播。与通常靶向tRNA反密码子环的先天免疫机制不同，Cas12a3对tRNA尾部的切割是一种更为根本且不易被病毒规避的策略。结构生物学研究揭示了其独特的tRNA装载域（tRLD）在底物识别和定位中的关键作用。此外，该研究还成功将Cas12a3的特异性应用于开发新型多重RNA诊断工具。这项工作不仅发现了一种以前未被认识的基于CRISPR的免疫策略，揭示了Cas12核酸酶功能多样性的新维度，而且为CRISPR技术工具箱增添了具有独特应用前景的新成员，尤其在多重生物传感和潜在的治疗干预方面。对PFS识别和tRNA结合机制的结构洞察也为进一步工程化改造Cas12a3奠定了基础。
