综述：从机制到敏感性：工程化CRISPR/Cas系统以实现临床级诊断

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：From Mechanism to Sensitivity: Engineering CRISPR/Cas Systems for Clinical-Grade Diagnostics

CRISPR/Cas系统通过多维度工程优化显著提升分子检测灵敏度，为无扩增POCT诊断提供技术路径，重点涉及Cas蛋白工程、crRNA设计及信号放大机制创新。

　　

廖敏志|陈璐|杨玉轩|易欣瑶|熊梦怡|袁琳

分子科学与生物医学实验室，化学与生物传感国家重点实验室，湖南大学化学与化学工程学院，化学与分子医学协同创新中心，长沙，410082，中国

摘要

准确且灵敏的分子检测是现代临床诊断和精准医学的基础。CRISPR/Cas系统的出现彻底改变了核酸检测的方式，为临床生物标志物分析提供了可编程的特异性和多功能适应性。然而，临床样本中与疾病相关的核酸本身含量较低，这仍然是一个主要障碍，因为基于CRISPR的检测方法的固有灵敏度往往不足以直接进行定量分析。为了弥补这一差距并实现临床应用，人们通过多方面的工程改造和优化努力提高了CRISPR的检测灵敏度。由于CRISPR系统的模块化结构，可以在多个层面提高灵敏度——包括Cas蛋白工程、crRNA设计、信号转导和反应条件优化，其中许多措施可以协同发挥作用。本文系统地总结了基于CRISPR的诊断方法在灵敏度提升方面的最新进展，并讨论了这些进展对开发无需扩增的即时检测平台（POCT）的意义。我们期望这项工作能为推进CRISPR技术向临床应用发展的研究人员提供一个概念框架和技术参考。

引言

准确高效的临床样本分析在生命科学和医学诊断中起着至关重要的作用。循环体液中的核酸（如ctDNA、mRNA和miRNA）是宝贵的生物标志物，能够实现遗传疾病的动态实时监测、传染病的预防以及肿瘤免疫疗法的进步。通过液体活检对这些分子进行定量分析具有显著优势，包括相对的分子稳定性、非侵入性以及可重复采样的可能性[1]。在过去的几十年里，定量聚合酶链反应（qPCR）由于其在核酸扩增方面的卓越灵敏度和可靠性，已成为分子诊断的金标准。为了克服与热循环相关的仪器和技术限制，人们开发了一系列等温扩增技术，包括环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和滚环扩增（RCA）[3]、[4]。随着对先进生物分析工具需求的增长以及全球健康挑战（如COVID-19大流行）的持续存在[2]，该领域最近取得了进展，这些进展旨在实现超高灵敏度、特异性和多功能性，同时个性化诊断在中心实验室和即时检测（POC）环境中也得到了快速发展。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统最初在细菌中被发现，其功能在于识别特定核酸序列后激活核酸酶，并已成为具有多种生物功能的强大分子工具[5]。由于CRISPR系统的卓越效率、精确性和可编程性，它们已经发展成为一种变革性的工具包，在基因工程、生物成像和体外诊断（IVD）中有着广泛的应用[6]。其中，Cas12a和Cas13a能够精确识别目标核酸并介导位点特异性的顺式切割，随后触发对单链DNA或RNA的强效非特异性反式切割活性[7]、[8]。利用这些优越特性，已经建立了多种基于CRISPR的即时检测（POCT）平台，包括DETECTR（DNA内切酶靶向CRISPR转录报告系统）[9]、HOLMES（低成本多功能高效系统）[10]和SHERLOCK（高灵敏度酶报告系统）[11]，用于灵敏且准确地检测DNA和RNA。与传统依赖昂贵仪器和熟练人员的PCR方法相比，CRISPR/Cas检测方法操作简便，便于开发便携式即用型诊断试剂盒。然而，基于CRISPR的技术尚未像PCR那样在临床上得到广泛应用，主要是由于其灵敏度存在固有限制。在临床样本中，ctDNA、miRNA和病毒RNA等核酸生物标志物的浓度通常非常低，常常低于CRISPR/Cas系统的检测阈值[9]、[12]、[13]。为了解决这一挑战，人们通过蛋白工程、crRNA修饰、报告基因优化以及添加化学物质或缓冲液等方式，致力于提高Cas蛋白的crRNA触发反式切割活性，这些措施共同显著提升了检测灵敏度。CRISPR系统的模块化结构使得这些策略能够协同作用，有可能将其分析灵敏度推向理论极限。因此，及时且系统地回顾这些进展对于全面了解当前进展、评估现有方法的优缺点以及加速基于CRISPR的诊断技术的临床转化至关重要。

本文总结了在无扩增条件下提高CRISPR/Cas检测灵敏度的现有策略，特别是那些使用Cas12和Cas13的方法。开发更有效的策略来增强Cas的反式切割活性需要全面理解该蛋白的结构和机制基础。为此，我们以Cas12a为例，说明了CRISPR系统的分子结构和激活机制。本节探讨了CRISPR/Cas的分类和结构特征、从crRNA结合到目标搜索的酶促途径，以及RuvC催化域在介导反式切割活性中的功能作用。基于这一机制理解，我们总结了提高内在检测灵敏度的五个关键要素，包括Cas蛋白工程、crRNA或DNA修饰、报告基因底物优化、反应添加剂以及酶级联耦合（图1）。最后，我们讨论了开发超灵敏CRISPR/Cas技术的剩余挑战和新兴机遇，强调了它们在推进临床诊断和实现下一代生物传感策略方面的潜力。

CRISPR/Cas的分类与特征

CRISPR/Cas系统的特点在于Cas蛋白的进化多样性，这种多样性是由病毒压力和水平基因转移驱动的，从而导致结构和功能的多样性。根据参与干扰阶段的效应模块的数量和组织方式，CRISPR/Cas系统可以分为两大类、六种类型和多个亚型。第1类系统包括I型、III型和IV型，它们依赖于多亚基复合体

蛋白工程

第2类CRISPR-Cas系统的功能由核糖核蛋白（RNPs）决定，这些核糖核蛋白包括Cas蛋白和crRNA，它们指导目标识别。然而，基于PAM（短回文序列）的固有激活机制限制了目标序列的可访问性。为了克服这一限制，人们通过氨基酸替换改造了Cas蛋白，使其能够识别非典型的PAM

结论与展望

本文系统总结了基于CRISPR-Cas12a系统的超灵敏单核苷酸多态性检测的最新进展。首先，我们概述了在没有预扩增的情况下定量低丰度目标的核心挑战，强调关键在于提高Cas12a的反式切割活性。为了提供这种增强的机制基础，我们详细描述了Cas12a的完整酶促循环过程，从crRNA组装和目标识别到RuvC域的作用

作者贡献声明

袁琳：撰写——审稿与编辑，监督。 陈璐：撰写——初稿。 杨玉轩：撰写——初稿。 易欣瑶：撰写——审稿与编辑。 熊梦怡：撰写——审稿与编辑，监督。 廖敏志：撰写——初稿

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本项工作得到了湖南省科学技术创新计划（项目编号2025RC3097）和国家自然科学基金（项目编号22474032）的资助。