CXCR5标记扁桃体中具有潜伏EBV特异性的干细胞样组织驻留记忆CD8+T细胞

《SCIENCE ADVANCES》：CXCR5 identifies stem-like resident memory CD8? T cells enriched for latent EBV specificity in tonsils

本研究针对慢性感染中CXCR5+CD8+T细胞功能属性及组织分布不清的问题，通过高维流式细胞术和单细胞测序技术，揭示了其在人体扁桃体等淋巴组织中富集，并表现出组织驻留记忆（TRM）和干细胞样特征，尤其富含针对EBV潜伏抗原的特异性。该发现为理解局部抗病毒免疫监视机制提供了新视角，对EBV相关疾病防治及疫苗设计具有重要意义。

　　

在我们身体的免疫系统中，有一支精锐的“特种部队”——记忆CD8⁺T细胞。它们像经验丰富的哨兵，在初次遭遇病原体后长期驻守，随时准备对再次入侵的敌人发起快速反击。根据其巡逻路线和驻扎地点，这些细胞被分为不同的亚群：主要在淋巴组织（Lymphoid Tissues, LTs）间循环的中心记忆T细胞（T_CM），巡逻于非淋巴组织（Non-lymphoid Tissues, NLTs）和血液中的效应记忆T细胞（T_EM），以及长期固守在特定组织的组织驻留记忆T细胞（Tissue-resident Memory T cells, T_RM）。其中，T_RM细胞在皮肤、肠道、肺部等黏膜屏障处扮演着至关重要的第一道防线角色。

然而，在复杂的淋巴组织内部，特别是像扁桃体这样的咽喉要道，记忆CD8⁺T细胞的具体分工和特性，尤其是它们如何应对那些擅长“潜伏”的病毒，仍有许多未解之谜。爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）就是一个典型的例子。这种病毒通过唾液传播，感染了全球绝大多数人口。它能在人体的B细胞中建立潜伏感染库，而扁桃体正是其主要的“藏身之所”之一。机体虽然建立了针对EBV潜伏期和裂解期抗原的记忆CD8⁺T细胞应答，但以往的研究多基于血液样本，这可能无法完全反映病毒潜伏基地——淋巴组织内的真实免疫状况。

近年来，一种表达CXCR5（一种趋化因子受体）的CD8⁺T细胞亚群逐渐引起关注。CXCR5通常帮助CD4⁺T滤泡辅助细胞（T_FH）定位到B细胞区辅助抗体产生。在慢性病毒感染（如小鼠的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、人类的HIV-1感染）模型中，CXCR5⁺CD8⁺T细胞显示出对病毒复制控制的重要性，甚至表现出干细胞样衰竭特征并对PD-1治疗有反应。也有研究表明扁桃体中存在CXCR5⁺CD8⁺T细胞，并能帮助B细胞产生抗体。那么，这些驻扎在EBV“大本营”——扁桃体里的CXCR5⁺CD8⁺T细胞，是否就是负责长期监视、控制潜伏EBV的关键力量？它们具有怎样的独特禀赋？为了回答这些问题，研究人员开展了一项深入探索。

本研究发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）杂志上。为了全面描绘CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞在人体内的分布与功能，研究人员综合利用了多种先进技术。他们首先通过流式细胞术分析了来自两个独立队列（IHOPE器官捐献者项目和TONCIM扁桃体切除项目）的多种组织样本，包括扁桃体、血液、脾脏、淋巴结以及多个非淋巴组织（如肝、肺、皮肤）和肠道相关淋巴组织，以绘制CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞的解剖学分布图谱。进而，他们采用高维单细胞技术，包括细胞索引转录本和表位测序（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing, CITE-seq）结合T细胞受体测序（T Cell Receptor Sequencing, TCR-seq），对匹配的血液和扁桃体来源的CXCR5⁺与CXCR5^-记忆CD8⁺T细胞进行了深入的转录组、蛋白表达和克隆结构分析。此外，研究还利用HLA I类四聚体（HLA class I tetramer）技术，精准鉴定并表征了针对巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）、流感病毒（Influenza virus, Flu）以及EBV潜伏期和裂解期免疫显性表位的病毒特异性记忆CD8⁺T细胞。最后，通过肽池刺激和细胞内因子染色等功能实验，评估了不同亚群细胞的功能特性。

CXCR5⁺CD8⁺T细胞在扁桃体中富集

研究人员发现，CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞虽然存在于所有检测的组织中，但其频率在淋巴组织（如淋巴结、肠道相关淋巴组织）中高于非淋巴组织（如血液、脾脏、肝、肺、皮肤）。尤为突出的是，扁桃体 harbored（容纳）了最高频率的CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞。在匹配的血液和扁桃体样本中，扁桃体内的CXCR5⁺细胞频率显著高于血液，并且这种富集现象在所有的记忆CD8⁺T细胞亚群（包括T_SCM, T_CM, T_EM, T_EMRA）中均存在，尤其在T_EM亚群中最为明显。扁桃体与血液中该细胞频率呈正相关，表明其分布存在系统性关联。

扁桃体局部的CXCR5⁺和CXCR5^-记忆CD8⁺T细胞在转录上截然不同

通过单细胞测序分析，研究人员发现，血液来源的CXCR5⁺和CXCR5^-记忆CD8⁺T细胞转录谱相似，而扁桃体来源的这两群细胞则明显分离，形成独特的聚类。扁桃体CXCR5⁺细胞高表达CXCR5 mRNA和蛋白，验证了分选策略。差异基因表达分析鉴定出8个主要细胞簇，揭示了不同的分化状态和功能倾向。扁桃体CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞过表达与人类干细胞样T细胞特征相关的基因（如TCF7），且其上调基因富集于T细胞受体信号、抗原加工以及EBV和CMV感染等通路。

扁桃体局部CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞表达富含Granzyme K的组织驻留特征

对比分析显示，血液CXCR5⁺细胞过表达效应分子（如GZMB, GZMH）和迁出受体（如S1PR1），而扁桃体CXCR5⁺细胞则过表达记忆相关分子（如GZMK, TCF7）、淋巴归巢受体（如CCR7）和粘附分子（如CRTAM）。在蛋白水平，扁桃体CXCR5⁺细胞更高表达组织驻留标志CD69和CD103，以及PD-1，呈现T_EM/T_RM表型（PD-1⁺CD38⁺CD62L^-CD127^-）。重要的是，扁桃体CXCR5⁺细胞显著高表达Granzyme K（GzmK），而非Granzyme B（GzmB）。体外培养实验进一步证实，扁桃体来源的CXCR5⁺细胞具有更低的HLA-DR和更高的CD49a、CD127、TCF1表达，表现出更早期分化和干细胞样特性。克隆分析表明，最大的克隆扩增是血液和扁桃体共享的，且这些共享克隆在扁桃体CXCR5⁺细胞中更为富集，提示T细胞受体（TCR）驱动的生态位偏好。CXCR5⁺和CXCR5^-细胞均表现出高度的TCR repertoire（受体库）多样性。

扁桃体局部CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞与病毒特异性相关

利用HLA I类四聚体技术，研究人员发现，针对CMV、EBV裂解抗原和流感病毒的特异性记忆CD8⁺T细胞在血液和扁桃体中频率相似，而针对EBV潜伏抗原的特异性细胞则在扁桃体中显著富集。病毒特异性细胞的表型特征主要取决于组织部位而非病毒特异性。无论抗原特异性如何，扁桃体局部的四聚体阳性细胞都更高表达CD39、CD69、CD103、CXCR3、CXCR5、CXCR6和HLA-DR等驻留和活化标志。在所有病毒特异性中，扁桃体CXCR5⁺细胞的频率均高于血液。表型主成分分析（PCA）显示，最大的差异存在于血液CXCR5^-细胞和扁桃体CXCR5⁺细胞之间，驱动因素包括CCR5、CD39、CD69、CD103、CXCR3和HLA-DR的表达。在扁桃体内，病毒特异性CXCR5⁺细胞比CXCR5^-细胞更高表达CCR5、CD27、CD38、CD69、CD95、CD103、CXCR3、HLA-DR、PD-1和TIGIT。

扁桃体中EBV特异性CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞呈现非细胞毒性的功能特征

功能实验表明，针对EBV潜伏和裂解抗原的特异性应答在扁桃体中比在血液中更频繁。在扁桃体中，响应抗原刺激的CXCR5⁺细胞频率高于血液，这在CMV和EBV特异性中均成立。在功能上，无论是哪个部位或针对哪种病毒，CXCR5⁺细胞都倾向于更高表达CD107a（脱颗粒标志）和TNF（肿瘤坏死因子），但更低表达GzmB。值得注意的是，针对EBV潜伏抗原的CXCR5⁺细胞在血液和扁桃体中均更高表达IFN-γ（干扰素-γ），而针对EBV裂解抗原的CXCR5⁺细胞仅在扁桃体中更高表达IFN-γ。CXCR5⁺细胞比CXCR5^-细胞更常表现为多功能性（同时产生多种细胞因子）。与扁桃体细胞相比，血液细胞总体上更具细胞毒性和多功能性。

扁桃体中EBV潜伏抗原特异性记忆CD8⁺T细胞呈现富含CXCR5表达的组织驻留表型

直接比较发现，在扁桃体中，针对EBV潜伏抗原的特异性细胞比针对裂解抗原的细胞更高频率地表达CXCR5，并且更富集组织驻留标志CD69和CD103。具有组织驻留表型（CD69⁺CD103⁺）的扁桃体记忆CD8⁺T细胞，无论其EBV抗原特异性如何，都更高表达CXCR5。扁桃体潜伏抗原特异性CXCR5⁺细胞通常共表达早期分化标志CD27和驻留标志CD103。功能上，响应抗原刺激的潜伏抗原特异性CXCR5⁺细胞频率高于裂解抗原特异性细胞。在扁桃体中，CD103⁺的EBV反应性细胞比CD103^-细胞更高频率地表达CXCR5。此外，扁桃体EBV反应性CXCR5⁺细胞比CXCR5^-细胞更高表达CD103、PD-1、干细胞因子TCF-1和活化标志41BB。

结论与意义

本研究通过综合运用高维技术，深入揭示了CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞在人体淋巴组织，尤其是扁桃体中的独特分布、表型、功能和特异性。研究结论可归纳为以下几点：首先，CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞主要定位于淋巴组织，扁桃体是其富集的核心区域。其次，扁桃体中的CXCR5⁺细胞表现出独特的干细胞样和组织驻留记忆（T_RM）特征，高表达TCF7、CD69、CD103等分子，并富含Granzyme K而非具有强细胞毒性的Granzyme B，功能上偏向非细胞毒性、多细胞因子产生的辅助样应答。第三，这些细胞与血液中的对应群体共享部分克隆，但具有独特的转录谱和生态位偏好。第四，尤为重要的是，扁桃体CXCR5⁺记忆CD8⁺T细胞显著富集针对EBV潜伏抗原（如EBNA3A, LMP2）的特异性，并与之相关的驻留/干细胞样表型（如PD-1⁺TCF-1⁺）。

这项研究的意义重大。它首次在人体生理状态下，系统描绘了扁桃体这一重要免疫器官中CXCR5⁺CD8⁺T细胞的全面特征，并将其功能状态与特定的病毒抗原（EBV潜伏抗原）监视直接联系起来。研究发现扁桃体中的CXCR5⁺CD8⁺T细胞汇聚了干细胞样和组织驻留记忆的特性，这类似于在慢性感染和癌症中描述的能维持耗竭T细胞应答并对免疫检查点阻断有反应的“干细胞样”前体细胞。这表明扁桃体中的这群细胞可能作为一个长期存在的储备库，能够在需要时（如EBV再激活）快速产生效应细胞，从而在病毒潜伏的“大本营”内实施高效且持久的免疫控制，同时避免过度的组织损伤。这一发现不仅深化了对局部抗病毒免疫，特别是对EBV这种重要病原体免疫监视机制的理解，而且为未来开发针对EBV相关疾病（如移植后淋巴增殖性疾病、某些淋巴瘤）的免疫治疗策略（如基于T细胞的疗法或疫苗）提供了新的靶点和思路。通过阐明组织微环境如何塑造T细胞的功能状态，本研究也为优化T细胞疗法以实现特定部位的有效性提供了重要见解。