《Applied and Environmental Microbiology》：Mechanisms of the marine yeast Debaryomyces hansenii for protection against reactive oxygen species produced during benzo(a)pyrene biotransformation
ABSTRACT
多环芳烃（PAHs），如苯并(a)芘（BaP），是持久性环境污染物，以其高毒性和对微生物降解的抵抗性而闻名。海洋酵母汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）因其能在多种胁迫条件下茁壮成长而成为一个引人注目的候选者。本研究对汉逊德巴利酵母暴露于BaP后的反应进行了分子和生化分析，揭示了其解毒和抗氧化机制。研究发现，汉逊德巴利酵母可在高达100 ppm的BaP浓度下生长而不影响细胞活力，并能在6天内生物转化近70%的化合物。此过程涉及细胞色素P450（CYP）、环氧水解酶（EH）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）等通常与异生素代谢相关的酶。BaP暴露导致显著的氧化应激，表现为活性氧（ROS）水平升高、脂质过氧化和蛋白质羰基化。然而，汉逊德巴利酵母激活了强大的抗氧化防御，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）以及谷胱甘肽氧化还原系统的调节。总之，这些结果表明，汉逊德巴利酵母在BaP生物转化过程中，通过一个将异生素代谢与抗氧化保护联系起来的协调酶网络来维持氧化还原稳态，从而扩展了机制理解并为未来在环境相关条件下的研究提供了基础。
INTRODUCTION
苯并(a)芘（BaP）是一种五环多环芳烃（PAH），来源于自然事件（如火山活动）和人为过程（包括化石燃料燃烧和烟草使用）。它广泛存在于煤渣、石油污泥、沥青和香烟烟雾中。其高化学稳定性决定了其在环境中的强持久性，使其抵抗自然降解并易于在土壤和水生沉积物中积累。因此，BaP被认为是陆地和水生生态系统中最持久和普遍存在的毒物之一。
人类通过燃烧排放物和食用受污染食物接触BaP的机会在近几十年有所增加。BaP通过吸入、摄入或皮肤接触被吸收，并被细胞色素P450（CYP）酶代谢成活性中间体。其中一个中间体是著名的BaP-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物（BPDE），具有致癌、致突变和致畸活性。除了这些经典的毒性效应，BaP还与神经毒性、表观遗传改变和生殖损害有关，突显了其对人类和环境的广泛影响。
由于BaP的持久性和毒理学相关性，人们对可持续修复策略的兴趣日益增长。其中，真菌修复（利用真菌降解或转化有机污染物）因其生态兼容性和酶促多功能性而受到关注。尽管传统方法通常依赖生化测定来衡量真菌的降解能力，但其潜在的代谢和调控机制仍然知之甚少。该领域的研究主要集中于子囊菌门和担子菌门的丝状真菌。相比之下，酵母虽然具有生长快速、易于遗传操作和显著的胁迫耐受性等优点，尽管具有相当大的生物技术潜力，但受到的关注有限。
在子囊菌门真菌（包括酵母）中，BaP的吸收主要通过其疏水性导致的被动扩散穿过脂双层发生。这种不依赖能量的过程使得PAHs能够在脂质囊泡中发生细胞内积累或瞬时储存。一旦进入细胞内，BaP经历三阶段生物转化：（i）细胞色素P450单加氧酶（CYP）、其NADPH依赖的还原酶（CPR）和环氧水解酶（EH）对芳香环进行氧化；（ii）活性中间体与谷胱甘肽、硫酸盐或葡萄糖等功能基团结合，主要由谷胱甘肽S-转移酶（GST）催化；以及（iii）通过液泡隔离或主动外排去除结合物。这种多酶系统，被称为异生素代谢组（xenome），代表了真菌异生素代谢的核心机制。全面了解该系统的分子调控和功能动力学对于推进对真菌适应有毒化合物的认识至关重要，并可能最终导致未来的应用研究。
BaP生物转化过程中的一个主要挑战是早期氧化步骤中产生的氧化应激。作为副产物形成的活性氧（ROS）会损害脂质、蛋白质和核酸。为了对抗这一点，真菌激活了涉及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的抗氧化防御。这些防御的核心是还原型谷胱甘肽（GSH），一种多功能的三肽，能中和自由基并维持细胞内氧化还原平衡。
海洋酵母汉逊德巴利酵母因其能在抑制大多数真菌的环境条件下茁壮成长而受到越来越多的关注，这些条件包括高盐度、低温和高浓度的重金属或氧化剂（如H2O2）。其在生境中的持久性得益于能够利用多种碳源（包括烃类）的灵活代谢，以及在胁迫下维持氧化还原平衡和保护细胞组分的有效抗氧化系统。这些生理特性与其对盐度、温度波动、重金属和氧化剂的广泛耐受性一致，这些特性支撑了其承受化学要求苛刻环境的能力。基于这种极端耐受特性，汉逊德巴利酵母也被证明可以代谢PAHs；值得注意的是，BaP通过由DhDIT2编码的CYP酶进行转化。
最近，转录组学研究表明，当暴露于BaP时，汉逊德巴利酵母激活了一个复杂的代谢和应激反应通路网络。这些包括CYP和EH的氧化、通过谷胱甘肽依赖和ROS清除酶的抗氧化保护、代谢物的结合和输出、分解代谢以及膜重塑。尽管这些转录组预测勾勒了一个集成的代谢框架，但支持它们的生化证据仍然有限。
因此，本研究重点在于使汉逊德巴利酵母能够代谢BaP并抵御其转化过程中产生的氧化应激的功能机制。通过结合酶活性测定、氧化还原标记物和基因表达分析，我们表征了生物转化和抗氧化防御如何随时间协调。这些结果为了解汉逊德巴利酵母的适应策略提供了一个全面的框架，并突出了其未来环境应用的潜在相关性。
MATERIALS AND METHODS
菌株和培养
汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）Y7426菌株常规保存在固体YNBG培养基上，每月更新一次。培养基包含0.67%酵母氮基（不含氨基酸），2%葡萄糖，2%琼脂，以及以下氨基酸补充物：组氨酸（20 mg/L）、蛋氨酸（20 mg/L）、色氨酸（20 mg/L）、亮氨酸（30 mg/L）和赖氨酸（100 mg/L）。确定的YNB配方由5.0 g/L (NH4)2SO4、1.0 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4、0.1 g/L NaCl、0.1 g/L CaCl2、微量元素和维生素组成。
培养物在含有250 mL液体YNBG的500 mL锥形瓶中进行，于28°C、250 rpm振荡培养24小时。
对于BaP暴露，通过将10 mg苯并(a)芘溶解于1.0 mL分析级丙酮中制备10,000 ppm储备液。将储备液加入培养基至终浓度100 ppm。最终丙酮浓度保持在1%以下，该条件先前已验证对汉逊德巴利酵母的生长或代谢无影响。实验培养物以OD600= 0.1起始。
生长和存活测定
生长和存活测定在无菌条件下进行，使用三个独立的生物学重复，每个重复进行技术重复分析。生长条件先前已为该酵母在相同组成的培养基中建立。
对于固体培养基上的生长，将预培养24小时的细胞用无菌水洗涤两次，调整至OD600= 1.0。在96孔板中制备十倍系列稀释液，使用多针复制器将每个稀释液5 μL点样到YNBG和YNB + 100 ppm BaP琼脂平板上。平板在28°C培养，每天监测，持续6天。
对于生长曲线分析，使用24小时预培养物调整至OD600为0.03，接种到相应培养基中。培养物在28°C培养，使用自动酶标仪每30分钟记录OD600，持续6天。
对于生物量定量，使用预培养物接种50 mL培养基，初始OD600= 0.1。每24小时，取1 mL等分试样通过预称重的0.22 μm膜过滤，用无菌水洗涤两次，并在95°C干燥至恒重。最终干重在分析天平上记录。
BaP去除测定
通过荧光分光光度法量化BaP去除，该方法已通过气相色谱-质谱联用验证。所有测定均进行三次重复，使用三个独立的生物学重复。
将预培养24小时的汉逊德巴利酵母细胞用无菌水洗涤两次，用于接种250 mL YNB + 100 ppm BaP培养基，初始OD600= 0.1。在第0、1、2、3和6天收集样品（3.0 mL），并于-20°C保存用于BaP提取。
残留BaP通过将每个样品与3.0 mL氯仿混合三次进行提取，随后涡旋并在3,000 rpm离心5分钟以分离相。回收有机相，在62°C蒸发，残余物重新悬浮于3.0 mL丙酮中。使用荧光分光光度计测量荧光，并根据在相同溶剂条件下制备的标准曲线计算浓度。
为考虑BaP的非生物损失，设置了两个阴性对照：无细胞培养基对照和热灭活生物量对照，以区分生物降解与物理吸附。
RNA提取
汉逊德巴利酵母细胞最初在250 mL YNBG培养基中于28°C、250 rpm振荡培养24小时。预培养后，收集细胞，用无菌水洗涤两次，接种到含有YNBG或YNB + 100 ppm BaP的50 mL锥形瓶中，初始OD600= 0.1，并在相同条件下培养0、1、2、3和6天。
对于RNA提取，从每个采样日收集15 mL培养物。细胞通过离心沉淀，并重悬于1.0 mL AE缓冲液中。使用改良的酚-SDS法提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳确认RNA完整性。
基因表达研究：cDNA合成和RT-qPCR
总RNA用DNase I处理以去除基因组DNA污染，并使用逆转录系统合成cDNA。通过RT-qPCR分析基因表达，使用四个独立的生物学重复和每个样本两个技术重复。
使用针对24个开放阅读框的特异性引物进行RT-qPCR，这些ORFs在NCBI基因表达综合数据库的RNA-Seq数据集中被鉴定为上调。相应的基因直系同源物在MycoCosm数据库中鉴定。
从NCBI检索序列，使用Primer-BLAST设计引物，并使用DINAMelt评估二聚体形成和特异性。在Rotor-Gene Q热循环仪上使用SYBR Green化学进行qPCR。使用2-ΔΔCT方法计算相对基因表达水平，以YNBG培养的细胞作为校准器。表达值归一化至DhACT1。
蛋白质提取物的制备
将预培养24小时的细胞在YNBG中培养，收集，用无菌水洗涤两次，然后用于接种250 mL YNBG或补充有100 ppm BaP的YNB，初始OD600= 0.1。培养物在28°C、250 rpm振荡培养，并在第0、1、2、3和6天取样。
细胞通过离心收集。沉淀重悬于补充有蛋白酶抑制剂的MOPS缓冲液中。加入玻璃珠，使用珠磨仪在冰上破碎细胞，进行六个30秒的均质化循环，间隔2分钟。所有步骤在4°C进行。通过离心去除细胞碎片，澄清的上清液用于后续酶活性测定。
酶活性
在酶活性测定之前，将细胞提取物获得的澄清上清液离心。使用Lowry法测定蛋白质浓度。所有酶活性随后使用紫外/可见分光光度计测量。
细胞色素P450（CYP）活性通过测量NADPH-细胞色素c还原酶（CPR）间接估计，CPR作为CYP介导反应的电子供体蛋白。使用商业试剂盒量化CPR活性。酶活性值归一化至蛋白质含量。
环氧水解酶（EH）活性根据文献方法测定，略有修改。反应在3 mL混合物中进行，监测290 nm处吸光度的增加。使用苯甲醛的摩尔消光系数计算比活性。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性根据文献方法测定，略有修改。每个2 mL反应混合物包含磷酸钠缓冲液、还原型谷胱甘肽（GSH）、1-氯-2,4-二硝基苯和蛋白质提取物。通过监测340 nm处吸光度的增加来追踪GSH-CDNB结合物的形成。使用该结合物的摩尔消光系数计算比活性。
谷胱甘肽还原酶（GR）活性根据文献方法估计，略有修改。每个2 mL反应混合物包含磷酸钠缓冲液、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、NADPH和蛋白质提取物。监测340 nm处吸光度的降低。使用NADPH的消光系数计算比活性。
谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性根据文献方法测定，略有修改。每个2 mL反应混合物包含磷酸钠缓冲液、GSH、NADPH、谷胱甘肽还原酶、H2O2和蛋白质提取物。监测340 nm处吸光度的降低。使用NADPH的消光系数计算比活性。
超氧化物歧化酶（SOD）活性根据文献方法测量，略有修改。每个2 mL反应混合物包含磷酸钠缓冲液、EDTA、蛋氨酸、NBT、核黄素和蛋白质提取物。对照反应包含等体积的缓冲液代替蛋白质。将混合物暴露于荧光灯下10分钟以启动反应，随后在黑暗中孵育10分钟。测量560 nm处的吸光度。SOD活性表示为抑制50% NBT还原所需的酶量。
过氧化氢酶（CAT）活性根据文献方法测定，略有修改。每个反应混合物包含磷酸钠缓冲液和H2O2。通过测量240 nm处吸光度的降低来监测H2O2的分解。使用H2O2浓度校准曲线计算特异性CAT活性。
还原型和氧化型谷胱甘肽的定量
对于谷胱甘肽定量，使用上述制备的细胞提取物的上清液；浓度归一化至总蛋白质含量，并表示为每毫克蛋白质的GSH或GSSG μmol。
谷胱甘肽水平根据文献方法测定。提取物用磷酸脱蛋白，在4°C孵育20分钟，并离心。GSH水平基于其与DTNB在412 nm处的反应进行定量。使用GSH系列稀释液制备标准校准曲线以计算样品浓度。
为测量GSSG，首先用2-乙烯基吡啶衍生化游离GSH。然后使用GR和NADPH将GSSG还原为GSH，并在412 nm处测量所得DTNB-GSH复合物的吸光度。使用GSSG标准品生成单独的标准曲线，并进行相同的衍生化和还原步骤。
氧化应激标记物的定量
使用两种具有不同亚细胞特异性的荧光探针在6天内监测细胞内活性氧积累。使用H2DCF-DA估计细胞质ROS，而使用DHR123评估线粒体ROS。在YNBG或YNB + 100 ppm BaP中生长的细胞每天收集，用无菌水洗涤两次，并与探针在30°C黑暗中孵育30分钟。在微孔板读数器中记录荧光。信号强度归一化至在同一设备中测量的细胞密度。这些测定提供了ROS积累的相对估计，并且不区分单个物种。
通过量化丙二醛（MDA）来评估脂质过氧化，MDA是多不饱和脂肪酸氧化的稳定终产物。细胞提取物按上述方法制备，用三氯乙酸脱蛋白，在冰上孵育10分钟，并离心。将上清液与硫代巴比妥酸混合，并在95°C加热60分钟。冷却后，测量MDA-TBA加合物在532 nm处的吸光度。使用摩尔消光系数计算MDA浓度，并归一化至总蛋白质含量。
通过量化羰基来评估蛋白质氧化。细胞提取物按上述方法制备，上清液与DNPH在室温黑暗中孵育1小时。蛋白质腙用TCA沉淀，用乙醇/丙酮洗涤，并重新溶解。测量370 nm处的吸光度。使用摩尔消光系数计算羰基含量，并相对于总蛋白质表示。
统计分析
使用GraphPad Prism 10进行统计分析。数据表示为三个独立生物学重复的平均值±标准差。对于一些图表，计算曲线下面积并用于后续统计分析。
当比较两个以上组时，应用标准单因素方差分析，假设正态分布和方差齐性。然后，进行Tukey多重比较检验。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，并通过Brown-Forsythe和Bartlett检验评估方差齐性。对于两组之间的比较，应用非配对Student t检验，假设方差相等。当P < 0.05时认为差异具有统计学显著性。确切的P值和显著性水平在相应的图注中报告。
RESULTS
为了表征汉逊德巴利酵母对BaP暴露的反应，我们结合了生长测定、BaP去除测量、靶向基因表达分析、酶活性测定和氧化应激标记物。这种多层次方法使我们能够在受控实验室条件下检查异生素生物转化和抗氧化防御之间的时间协调性。
测定表明，汉逊德巴利酵母在固体和液体培养基中均能在100 ppm BaP存在下生长，荧光定量显示在6天内信号下降约70%，与先前的观察一致。
在液体培养中，倍增时间从约7.5小时增加到约18.3小时。在整个时间过程中，生物量积累仍低于葡萄糖条件，基于曲线下面积的比较证实了条件之间的显著差异。
在确认生长和BaP去除后，我们使用第3天的RNA-Seq数据选择了24个与解毒、谷胱甘肽稳态和抗氧化防御相关的ORFs。我们设计了靶向引物，并在对照和BaP条件下于第0、1、2、3和6天进行了RT-qPCR；结果中的热图总结了完整数据集。
暴露于BaP诱导了汉逊德巴利酵母中解毒酶的协调激活，表现为CYP、CPR、EH和GST ORFs的上调及其相应的活性。CYP和CPR参与BaP氧化，EH将产生的环氧化物转化为二醇，GST将GSH与这些中间体结合。所有三种酶在BaP处理下于第3天表现出最大活性，与最高的化合物转化速率一致。在葡萄糖对照中活性保持稳定，表明是BaP特异性反应。第1天CPR和EH的轻微早期增加可能反映了非特异性细胞调整。
考虑到对氧化还原平衡的影响，量化了细胞内GSH和GSSG，计算了总谷胱甘肽，并使用GSH/GSSG比率作为氧化还原指标。我们还测量了谷胱甘肽合成酶的表达，以评估是否诱导了GSH的从头合成作为补偿反应。
暴露于BaP导致细胞内GSH水平显著下降，特别是在第6天，与其在结合和抗氧化防御中的主动消耗一致。同时，GSSG水平显著增加，GSH/GSSG比率下降，证实了氧化环境以及谷胱甘肽池参与维持氧化还原平衡。尽管有这种消耗，总谷胱甘肽池稳步上升，伴随着谷胱甘肽合成酶表达的上调。这种协调模式表明汉逊德巴利酵母通过刺激谷胱甘肽的从头合成来补偿氧化应激。
考虑到谷胱甘肽稳态的改变，下一步是检查ROS的积累。BaP暴露导致细胞质和线粒体ROS的快速增加，从第1天即可检测到。双重定位表明氧化应激源于多个细胞来源，
