《Ecotoxicology and Environmental Safety》：A BDE-47/estrone mixture modulates macrophage immune responses and miRNA networks, impairs intestinal barrier integrity in vitro, and alters circulating miRNAs and tight junction expression in vivo
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本研究针对环境污染物混合暴露的健康风险，通过体外巨噬细胞与肠道上皮细胞模型及大鼠体内实验，揭示了BDE-47/雌酮混合物在无细胞毒性浓度下协同激活炎症反应、下调免疫调控miRNA（如let-7a-5p、miR-128-3p），并破坏肠道紧密连接蛋白（如Occludin、E-cadherin）表达。研究首次发现巨噬细胞分泌组可部分逆转混合物对上皮屏障的损伤，同时在大鼠血浆中鉴定出炎症相关循环miRNA（如miR-21-5p、miR-150-5p）上调，为低剂量污染物混合暴露的免疫毒性机制提供了新证据，强调混合物风险评估的重要性。
在现代工业化和城市化进程中，人类不可避免地暴露于多种环境污染物构成的复杂混合物中。这些污染物包括持久性有机污染物（POPs）、内分泌干扰物（EDCs）等，它们通过空气、水和食物链进入人体，即使单个化合物浓度低于传统毒理学认定的安全阈值，其混合效应也可能对健康构成潜在威胁。然而，当前的环境风险评估体系仍主要依赖于单一化合物的毒性数据，难以真实反映实际暴露场景的健康风险。尤其值得关注的是，免疫系统和肠道屏障作为抵御外源物质入侵的首道防线，其对污染物混合暴露的敏感性及应答机制尚不明确。
在此背景下，来自意大利国家研究委员会生物医学研究与创新研究所的Noemi Aloi、Valeria Longo等研究人员在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表论文，聚焦于两种典型环境污染物——多溴二苯醚BDE-47（一种广泛使用的阻燃剂）和天然雌激素雌酮（E1）。这两种污染物在意大利西西里岛沿海工业区环境中被频繁检出，可能通过海产品摄入等途径进入人体。研究团队通过整合体外细胞模型和动物实验，系统探讨了BDE-47与E1单独及混合暴露对免疫细胞功能、肠道屏障完整性及表观遗传调控的影响，旨在揭示低剂量污染物混合作用的潜在机制。
研究团队运用了多种关键技术方法：通过MTS法和DCFH-DA法评估细胞活性和氧化应激水平；采用实时荧光定量PCR（qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）分析炎症因子及紧密连接基因表达；利用跨上皮电阻（TEER）测量技术检测肠道屏障功能；通过miRNA微阵列芯片分析巨噬细胞内及大鼠血浆中miRNA表达谱；结合生物信息学工具（如ReactomePA、DOSE软件包）进行通路富集分析；并对大鼠肠道组织进行组织学检查。动物实验使用Wistar大鼠，通过30天灌胃暴露模拟慢性低剂量接触。
3.1. 巨噬细胞暴露于污染物后未出现细胞毒性及氧化应激
研究人员首先在RAW 264.7巨噬细胞中评估了BDE-47、E1及其三种混合比例（MIX 1-3）的细胞毒性。结果表明，在测试浓度范围内（BDE-47: 3-3000 nM，E1: 0.1-100 nM），单一污染物或混合物处理24小时后，细胞存活率与对照组无显著差异。同时，DCFH-DA荧光探针检测显示，各处理组活性氧（ROS）水平也未发生明显变化，说明在此暴露条件下，污染物未引发基础细胞损伤或氧化应激。
3.2. 混合物协同激活巨噬细胞炎症反应
尽管未引起细胞毒性，qPCR分析发现MIX 3（300 nM BDE-47 + 1 nM E1）显著上调了炎症基因TNF-α、IL-6和抗炎基因IL-10的表达，而单独暴露于任一化合物则无此效应。ELISA进一步证实MIX 3处理组细胞上清液中TNF-α蛋白分泌量显著增加，提示混合物对巨噬细胞活化具有协同增强作用。
3.3. 混合物改变巨噬细胞内miRNA表达谱
通过miRNA芯片检测，研究团队发现MIX 3引起巨噬细胞内4种miRNA的显著下调：let-7a-5p、miR-423-5p、let-7c-5p和miR-128-3p。这些miRNA已知参与免疫调节和炎症信号通路的负向调控，其下调可能与观察到的炎症基因激活相关。
3.4. 生物信息学分析揭示潜在调控通路
对上述miRNA的靶基因进行Reactome通路富集分析，结果显示显著富集的通路包括“RHO GTP酶循环”、“生长因子受体信号转导疾病”和“TP53转录调控”等，涉及细胞周期、应激反应及PI3K/AKT信号转导等关键生物学过程，提示污染物混合物可能通过表观遗传机制影响细胞稳态。
3.5. 混合物直接损害肠道上皮屏障功能
在Caco-2肠道上皮细胞模型中，MIX 3直接暴露虽未影响细胞活力，但显著降低了E-cadherin和occludin的基因表达，并导致TEER值下降，表明肠道屏障通透性增加。有趣的是，用经MIX 3处理的巨噬细胞条件培养基（CM-MIX 3）干预Caco-2细胞后，E-cadherin表达得以部分恢复，提示巨噬细胞分泌的某些因子可能对上皮屏障具有保护性调节作用。
3.6. 体内实验验证肠道屏障损伤及循环miRNA改变
在大鼠30天灌胃暴露实验中，混合物处理组结肠组织occludin基因表达显著下调，组织学检查显示上皮连续性轻微破坏及轻度炎症细胞浸润。同时，血浆miRNA分析发现4种炎症相关miRNA（miR-21-5p、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-363-3p）显著上调。疾病本体（DO）富集分析提示这些miRNA的靶基因与肠道癌、神经系统疾病等病理过程密切相关。
本研究通过多层次实验证实，低剂量BDE-47和E1混合物在无明显细胞毒性的暴露水平下，仍能通过协同作用激活巨噬细胞炎症应答、扰动miRNA调控网络，并直接或间接（经由免疫细胞-上皮细胞互作）损害肠道屏障功能。体内外实验的一致性进一步说明，循环miRNA可能作为污染物早期暴露的敏感生物标志物。该研究突破了传统单一化合物毒理评估的局限，强调了基于混合物真实暴露场景进行环境健康风险评价的重要性，为理解低剂量污染物混合暴露的免疫毒性及表观遗传机制提供了新的实验依据，对制定更精准的公共卫生干预策略具有重要参考价值。
