PFKFB3参与的糖酵解代谢有助于脓毒症诱导的中性粒细胞胞外陷阱的形成

《International Immunopharmacology》：PFKFB3-involved glycolytic metabolism supports sepsis-induced neutrophil extracellular trap formation

脓毒症中PFKFB3介导的糖酵解重编程通过PAD4依赖的染色质解聚促进中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成，抑制PFKFB3可减轻肺损伤并提高生存率。

　　

江涛·尹|曹霞·吴|吴武涛|肖敏|彭静文|刘超|刘国英|刘大东

江苏省人民医院消化疾病研究所重症医学科，中国江苏省镇江市

摘要

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的无控制形成是导致脓毒症患者死亡的主要机制之一。PFKFB3是一种重要的糖酵解代谢酶，参与粒细胞的炎症激活。我们之前的研究表明，PFKFB3参与的糖酵解代谢支持CXCR4^hi中性粒细胞的炎症激活，这是脓毒症引起肺部炎症损伤的关键机制。然而，PFKFB3在脓毒症中支持NET形成的具体机制尚不清楚。在这里，我们发现中性粒细胞中PFKFB3的高表达对脓毒症诱导的NET形成至关重要。进一步的机制研究表明，PFKFB3通过糖酵解重编程和肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）依赖的染色质解凝聚促进脓毒症相关的NET形成。然而，抑制PFKFB3支持的糖酵解代谢可以显著减少PAD4依赖的NET形成，并减轻脓毒症相关的肺部炎症损伤。总之，我们的研究结果表明，PFKFB3支持的糖酵解代谢通过PAD4介导的染色质解凝聚促进脓毒症诱导的NET形成。针对PFKFB3支持的糖酵解可能是缓解脓毒症引起的过度炎症和组织损伤的潜在策略。

引言

脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍，仍然是重症监护病房（ICU）的主要死亡原因[[1], [2], [3], [4]]。中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的无控制形成是导致脓毒症患者器官炎症损伤甚至死亡的重要机制[5]。

NETs是一种富含DNA的独特结构，表面装饰有抗菌肽，由Brinkman等人于2004年首次描述并命名[6]。自从发现以来，NETs因其在多种病理生理过程中的作用而成为科学研究的焦点。从积极的角度来看，NETs被认为具有中性粒细胞的新杀菌功能。NETs通过捕获和杀死入侵的病原体来保护宿主[[5], [6], [7]]。然而，除了抗菌作用外，NETs在脓毒症的发生和发展中也起着有害作用。过度的NET形成会加剧炎症和无控制的器官功能障碍[[8], [9], [10]]。因此，了解NET的形成可能为脓毒症的治疗提供潜在的线索。

糖酵解是中性粒细胞的主要能量来源，在脓毒症中起着关键作用[11]。过去十年中，许多研究表明NET的形成涉及中性粒细胞糖酵解的重编程[[12], [13], [14]]。关于糖酵解及其代谢酶的研究是与NET形成相关的一个热门研究课题。众所周知，6-磷酸果糖激酶-1（PFK-1）是调节糖酵解流量的关键酶。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3）是唯一能够通过维持细胞内果糖-2,6-二磷酸（F2,6-BP）水平来促进PFK-1别构激活的酶。当前的研究表明，PFKFB3在各种组织中普遍存在，并显著加剧了脓毒症期间对器官和组织的炎症损伤[[15], [16], [17], [18], [19]]。靶向调节巨噬细胞中的PFKFB3表达显著减轻了脓毒症引起的器官炎症损伤。我们之前的研究表明，中性粒细胞中PFKFB3支持的糖酵解重编程参与了中性粒细胞的炎症激活[20]。此外，我们报告称CXCR4^hi中性粒细胞通过促进NET的形成加剧了脓毒症相关的肺部炎症损伤，这一过程由PFKFB3支持的糖酵解代谢介导[21]。然而，PFKFB3在脓毒症期间支持NET形成的详细机制仍不清楚，需要进一步探索。

在这里，我们发现中性粒细胞中PFKFB3的表达与脓毒症患者的NET形成密切相关，抑制PFKFB3的活性可以减少NET的形成，减轻肺部炎症损伤，并提高接受盲肠结扎和穿刺（CLP）处理的小鼠的存活率。进一步的研究表明，PFKFB3介导的NET形成涉及中性粒细胞糖酵解代谢的重编程和肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）的激活，后者是NET形成的核心酶。我们的结果为脓毒症的预防和治疗提供了新的见解。

材料与方法

涉及人类参与者（健康志愿者和脓毒症患者）的研究得到了南京医科大学金陵医院医学伦理委员会（2022DZGZR-017）和江苏大学医学伦理委员会（KY20210702–3）的批准。所有参与者均签署了知情同意书。动物实验得到了金陵医院动物护理和使用委员会的批准（2022DZGKJDWLS-0057）。

2.8 qRT–PCR

通过qRT–PCR测量原代中性粒细胞中基因（包括Pfkfb3、Slc2a1、Hk2和Pad4）的表达。从相关细胞中独立提取总核糖核酸，并立即反转录为cDNA。随后使用一步SYBR Premix Ex Taq在PCR仪器中扩增cDNA。根据目标基因和GAPDH的Cp值确定相对基因表达。用于扩增目标基因和GAPDH的引物（表S3）。

PFKFB3表达与NET形成密切相关

在脓毒症的急性期，中性粒细胞被认为是首先被招募到受影响区域的介质，它们有助于消除微生物感染[31]。NETs是一把双刃剑，既能消灭病原微生物，也会引起器官损伤[[5], [6], [7], [8], [9], [10]]。我们之前的研究表明，PFKFB3参与的糖酵解代谢支持中性粒细胞的炎症激活[20]，而CXCR4^hi中性粒细胞通过促进NET的形成加剧了脓毒症引起的肺部炎症

讨论

PFKFB3是一种双功能酶，在细胞糖酵解过程中起着核心调节作用。PFKFB3的活性通过不同位点的磷酸化修饰精确调控。PFKFB3 Ser461位点的磷酸化可以增强其激酶活性，从而通过上调F-2,6-BP的产生加速糖酵解过程[49]。研究表明，PFKFB3 Ser461位点的磷酸化是快速增强糖酵解的关键机制

CRediT作者贡献声明

江涛·尹：撰写——原始草案，资金获取，概念构思。曹霞·吴：验证，软件，方法学。吴武涛：可视化，数据管理。肖敏：方法学，正式分析。彭静文：项目管理。刘超：撰写——原始草案，调查，概念构思。刘国英：监督，资源获取，资金获取。刘大东：撰写——审稿与编辑，可视化，资金获取，数据管理，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢所有参与这项研究的小鼠的牺牲。同时，我们也感谢所有参与这项研究的患者和健康志愿者为血液样本的收集所做的贡献。

本研究得到了国家自然科学基金对刘大东（82202389）和刘国英（82102547）的支持，以及江苏大学医学教育协同创新基金对江涛·尹（JDY2023004）的支持。