《Chemical Engineering Journal》：PET hydrolase mitigated the accumulation of antibiotic resistance genes in plastisphere during high temperature sludge composting
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环境聚对苯二甲酸乙二醇酯微塑料（PET-MPs）通过促进微生物定殖和抗生素耐药基因（ARGs）扩散加剧污染。研究显示，添加PET水解酶WCCG可使高温堆肥系统中PET-MPs降解35.24%，并降低ARGs积累38.93%（堆肥）和26.99%（塑料微环境）。塑料微环境（plastisphere）中ARGs丰度达堆肥的32倍，WCCG通过破坏生物膜和基因水平转移机制削弱病原菌与ARGs的正相关性。
李晓晓|张月|刘欣欣|宋柯|郑先青|吕伟光|穆罕默德·哈立德|马丁·罗曼丘克|南辉
上海农业科学院生态环境保护研究所，中国上海201403
摘要
环境中的聚对苯二甲酸乙二醇酯微塑料（PET-MPs）为微生物定殖提供了持久的表面，并促进了抗生素抗性基因（ARGs）的传播。我们之前已经证明，PET水解酶（WCCG）可以在高温污泥堆肥过程中有效分解PET-MPs，但ARGs对该酶添加剂的反应及其机制仍不清楚。在本研究中，我们使用高通量测序和qPCR技术，在220升的污泥堆肥器中测试了WCCG对PET-MPs的降解效果、微生物群落以及ARGs的影响。结果表明，虽然堆肥可以显著减少对照组中的ARGs，但在第50天时，添加PET-MPs后，ARGs和intI1的含量分别增加了262.3%和747.0%。令人惊讶的是，塑料微生态圈成为了一个持续的热点区域，其中ARGs的含量比堆肥样本高出多达32倍，尤其是tetG和ermF。在第50天时，添加WCCG后，堆肥中的ARGs减少了38.93%，而在塑料微生态圈中减少了26.99%。ARGs的含量与致病菌属（如Psychrobacter、Erysipelothrix和Clostridium）之间存在显著的正相关关系。通过抗性筛选，我们分离出了Psychrobacter griseus，并确认其携带特定的ARG（tetG）。WCCG改变了塑料微生态圈中与tetG相关的积累途径，减弱了Psychrobacter属与tetG含量之间的正相关关系。这些发现表明，利用酶促PET降解是一种潜在的策略，可以同时减少微塑料污染并减缓堆肥系统中的抗生素抗性传播，为MPs、ARGs和微生物群落之间的相互作用提供了新的见解。
引言
微塑料（MPs，<5毫米）由于其普遍性和在陆地和水生生态系统中的持久性，已成为最令人担忧的环境污染物之一[1]。在合成聚合物中，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是最广泛使用的塑料之一[2]。由于其理想的物理化学性质，PET被广泛用于一次性包装，全球年产量已超过5300万吨[3]。在使用和处置过程中，PET会发生破碎、磨损和降解，形成聚对苯二甲酸乙二醇酯微塑料（PET-MPs），这些微塑料随后通过废水系统进入污水处理厂（WWTPs）[4]。据估计，超过90%的MPs滞留在污泥中[5]。抗生素抗性被公认为一个紧迫的全球环境和公共卫生危机，预测表明，如果不采取有效措施，到2050年每年可能导致多达1000万人死亡[6]。抗生素抗性基因（ARGs）在环境中的传播与人类活动密切相关，特别是废水排放[7]、污泥利用[8]和固体废物回收[9]。最新证据进一步表明，MPs可以促进水平基因转移，从而可能成为ARGs的载体[10]、[11]、[12]。嗜热堆肥被认为是减少污水污泥中ARG污染的有效方法，因为嗜热条件（>55°C）可以杀死耐药细菌细胞、分解细胞外DNA并抑制水平基因转移（HGT）[13]。然而，PET-MPs在堆肥过程中对ARGs动态的影响仍知之甚少。
MPs容易在其表面形成密集的微生物生物膜，形成了一个被称为“塑料微生态圈”的独特生态位[14]。由于其疏水性和环境持久性，MPs提供了持久的附着位点和受保护的微生境，促进了微生物定殖、细胞间相互作用和水平基因转移（HGT）[15]、[16]。证据表明，塑料微生态圈是ARGs和潜在病原体的储存库和避难所，从而促进了抗生素抗性的传播，并对疾病传播和治疗产生了潜在影响[17]、[18]、[19]。一项实验室研究表明，塑料微生态圈是ARGs和致病菌的热点区域，塑料上的质粒转移频率通常高于自由生活的细菌[20]。然而，尽管取得了这些进展，大多数研究主要集中在自然环境中，如土壤、叶层和水生系统，而塑料微生态圈在工程生态系统中的作用，特别是在高温污泥堆肥中的作用，仍然很大程度上未被探索。
鉴于PET-MPs的生态风险，酶促生物降解已成为一种有前景且环保的策略，用于减轻微塑料积累[21]、[22]、[23]。最近的进展发现了一些类似角质酶的水解酶，如工程变体WCCG，它们对PET聚合物表现出显著的催化活性，在优化实验室条件下可实现高达90%的降解[24]、[25]、[26]。我们之前的研究表明，当WCCG应用于堆肥系统时，可以降解高达35.24%的PET-MPs，这一速率明显高于自然风化速率（25.76%）[27]、[28]。这些发现表明，WCCG可以有效地纳入高温堆肥过程中，以减少PET-MPs的长期持久性。然而，酶促降解PET-MPs是否能够有效减少塑料微生态圈中的ARGs积累仍需进一步研究。具体来说，目前尚不清楚PET水解酶是否改变了病原体、移动遗传元件（MGEs）和代谢功能共同驱动ARGs在塑料微生态圈中富集的途径。
因此，我们使用高通量测序和qPCR技术在220升的污泥堆肥器中评估了WCCG对微生物群落和ARGs的影响。我们假设：（i）PET-MPs会显著促进ARGs和intI1的积累，从而降低嗜热堆肥的固有ARGs去除效率；（ii）塑料微生态圈会成为ARGs和intI1的持续热点，其基因丰度和微生物网络复杂性高于堆肥样本；（iii）PET水解酶通过降解MPs、减少稳定附着位点和破坏与生物膜相关的HGT，从而减弱ARGs、MGEs和病原体之间的相互作用，部分缓解塑料微生态圈中的ARGs富集。
实验材料
脱水污泥来自中国上海的红桥净水厂，含水量约为15-20%。由上海千牛农业有限公司提供的芦笋秸秆经检测不含MPs，含水量也约为15-20%。聚对苯二甲酸乙二醇酯来自中国深圳的福新塑料原料有限公司，通过研磨转化为微塑料颗粒。
堆肥中ARGs含量的变化
为了减少微生物生物量对ARG分析的干扰，ARGs的绝对含量表示为ARG拷贝数与16S rRNA基因拷贝数的比值。所有堆肥处理在第二天都达到了嗜热温度（>62°C）（图S1）。此时，CK、PW和W组中的ARG含量分别相对于初始水平下降了96.05%、73.54%和75.36%，而P组则增加了17.40%，表明PET起到了显著的富集作用（图2a）。
堆肥过程中PET-MPs促进ARGs和intI1的积累
嗜热堆肥通常通过持续的高温使微生物宿主失活、裂解质粒并限制水平基因转移来减少ARGs[34]。在我们的研究中，所有不含PET的处理（CK、W）在第二天时ARGs的含量减少了75%以上，这与先前的研究结果一致，即嗜热和超嗜热条件可以减少污水污泥和食物垃圾堆肥过程中的HGT标记物（如intI1）和抗性基因组[35]、[36]。然而，PET的存在
结论
本研究表明，在嗜热堆肥过程中，PET微塑料显著促进了ARGs和整合酶基因intI1的积累，而在对照堆肥中它们的含量显著减少。塑料微生态圈成为了一个持续的热点区域，其中ARGs的含量比堆肥整体高出多达32倍，尤其是tetG和ermF。在第50天时，添加WCCG后，堆肥中的ARGs减少了38.93%，而在塑料微生态圈中减少了26.99%。通过
作者贡献声明
李晓晓：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、软件使用、方法论、研究、数据分析、概念化。张月：撰写 – 原稿、资源获取、方法论、研究、数据分析、概念化。刘欣欣：验证、数据分析。宋柯：数据可视化、验证、资源获取。郑先青：验证。吕伟光：研究、数据分析。穆罕默德·哈立德：研究。马丁·罗曼丘克：项目协调
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
