《MUTATION RESEARCH-GENETIC TOXICOLOGY AND ENVIRONMENTAL MUTAGENESIS》：Dynamic subcellular localization of HMGB1 in colorectal cancer cells following exposure to environmental mutagens
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HMGB1定位动态调控与不同环境诱变剂对DNA损伤的影响研究
马蒂尔德·马泰奥利（Matilde Matteoli）|奥罗拉·法拉斯基（Aurora Falaschi）|基亚拉·纳尔多尼（Chiara Naldoni）|多梅尼卡·迪贝洛（Domenica Di Bello）|弗朗切斯卡·切坎蒂（Francesca Ceccanti）|维罗妮卡·埃斯波斯蒂（Veronica Esposti）|芭芭拉·平托（Barbara Pinto）|西蒙娜·皮亚吉（Simona Piaggi）|罗伯托·斯卡帕托（Roberto Scarpato）
比萨大学（University of Pisa）生物系遗传学单元，地址：Via Derna 1，56126，比萨，意大利
摘要
高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在细胞生理中扮演双重角色：在细胞核内，它有助于染色质稳定和DNA修复；而当其转移到细胞质或释放到细胞外空间时，会触发自噬和炎症信号传导。我们研究了不同环境诱变剂如何影响两种结直肠癌细胞系HCT116TP53+/+和HCT116TP53-/-中HMGB1的定位。这些细胞在允许细胞增殖的同时暴露于紫外A辐射（UV-A）、蓝光、1,4-苯醌（BQ）或1,2,3,4-二环氧丁烷（DEB）下，以诱导基因毒性应激。DNA损伤通过γ-H2AX磷酸化检测或微核（MN）测试进行评估，后者分别用于检测双链断裂（DSBs）或染色体改变。UV-C辐射和丝裂霉素C（MMC）被用作阳性对照。所有这些因素都显著增加了p53正常和p53缺陷细胞中的DSBs形成及微核频率。处理前，HMGB1分布于细胞核和细胞质中；暴露于UV-A或蓝光后，该蛋白显著转移到细胞质中，表明应激诱导的炎症通路被激活；相反，BQ或DEB处理则导致HMGB1在细胞核中滞留，这与其在DNA修复中的作用一致。总体而言，这些发现表明，在HCT116肿瘤细胞中，HMGB1的定位会根据基因毒性应激的类型和持续时间动态调节：物理诱变剂促进细胞质信号传导，而化学诱变剂则增强细胞核修复机制。
引言
人类会接触到可能损害细胞结构（包括遗传物质）的物理和化学物质。太阳紫外线是一种有害的物理诱变剂。尽管UV-C被臭氧层屏蔽[1]，但到达地球表面的UV-A仍可作为诱变剂。UV-A可通过产生活性氧（ROS）诱导氧化应激，形成环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）[2]、DNA碱基氧化以及单链或双链断裂（DSBs）[3],[4]，这些事件与皮肤癌发生有关[5]。蓝光由太阳或人造光源（如显示器或LED设备[6]）发出，可导致光老化、视网膜损伤和白内障形成[7],[8]，同时也会增加ROS的产生并具有基因毒性[9]。
DEB和BQ是环境中的诱变剂。DEB是1,3-丁二烯的活性代谢物，存在于城市空气和香烟烟雾中[10]，基于“充分证据”被归类为人类致癌物，因为它会增加人类患白血病的风险、在实验动物中具有多部位致癌性，并具有基因毒性[11]。DEB可与DNA和蛋白质形成共价加合物，从而引发癌变[12]。BQ是苯的活性代谢物，苯是一种由内燃机车辆排放的环境污染物，也存在于香烟烟雾中。BQ在体外和体内[13]都能增加ROS的产生。接触苯会增加成人患骨髓增生异常综合征或急性髓系白血病的风险[14]。BQ还会导致DNA氧化损伤、脂质过氧化以及骨髓细胞中的DNA断裂[13]。
环境诱变剂还可以直接或间接影响生物大分子（如蛋白质）。HMGB1是一种非组蛋白蛋白，它与核小体间的连接DNA相互作用，导致结合位点处的双螺旋结构发生显著扭曲。这种DNA几何结构的局部改变有助于其他蛋白质（例如转录因子）与DNA结合[15]。HMGB1还参与DNA修复：它通过高亲和力结合DNA来识别受损部位，并通过与多种DNA修复酶的直接相互作用提高修复效率[16]。在病原体感染或氧化应激存在的情况下，翻译后修饰（如乙酰化）使HMGB1从细胞核转移到细胞质，在那里该蛋白在细胞反应中发挥积极作用[17]，抑制细胞凋亡、促进自噬，并调节线粒体功能和形态[18]。HMGB1还具有细胞外作用，主要表现为促进炎症[19]。该蛋白还可能与癌变有关：其过量产生可能导致慢性炎症，如果肿瘤细胞持续产生HMGB1，可能会加剧炎症本身引起的免疫抑制[20],[21]。
细胞内自由基种类的增加以及多种化学或物理因素都可能产生DNA双链断裂（DSBs）或阻止细胞正常进入有丝分裂。未修复或修复错误的DSBs以及染色体分离异常会导致基因组突变，这些突变可以在间期细胞的细胞质中通过微核（MN）等手段检测到[22]。这类损伤的诱导会改变细胞稳态，并导致HMGB1定位的变化。在本研究中，我们在两种结直肠癌细胞系HCT116TP53+/+和HCT116TP53-/-（常用于机制研究的细胞模型）中评估了这些物理和化学诱变剂诱导的基因毒性是否促进HMGB1的转移。基因组损伤通过两种不同但互补的检测方法进行评估：ser-139位点的H2AX磷酸化（γ-H2AX检测），该方法对检测和量化细胞系统中的DSBs非常敏感[23],[24]；以及微核检测，这是目前最常用的识别增殖细胞中染色体异常的方法之一[22],[25],[26]。HMGB1在细胞内的分布情况通过免疫荧光方法进行分析。
细胞系和培养
我们使用了两种二倍体人类结直肠腺癌细胞系HCT116TP53+/+和HCT116TP53-/-（来自美国马里兰州巴尔的摩的约翰霍普金斯癌症中心）。HCT116细胞在hMLH1基因中具有纯合无义突变（S252*），并在hMSH3基因中具有纯合缺失，导致错配修复（MMR）缺陷[27],[28],[29]。这两种细胞系均在McCoy’s 5A培养基（Euroclone，米兰，意大利）中培养，培养基中添加了10%胎牛血清（Euroclone，米兰，意大利）和1%青霉素/链霉素（Euroclone，米兰，意大利）。
结果
图3和图4展示了HCT116结直肠癌细胞系在物理和化学因素处理后的基因组损伤及HMGB1的细胞内定位情况。每张图包含两个图形部分，分别对应使用的诱变剂（UV-A和蓝光或BQ和DEB），展示了细胞通过组蛋白H2AX磷酸化（Iγ-H2AX）、微核频率（MN）和核-细胞质HMGB1转移（LIHMGB1）的反应。
暴露于UV-A后……
讨论
我们评估了两种人类结直肠癌细胞系HCT116TP53+/+和HCT116TP53-/-在受到物理（UV-A和蓝光）和化学（DEB和BQ）诱变剂处理后的HMGB1蛋白的亚细胞定位。诱变剂的效果通过γ-H2AX和MN检测方法进行评估[25],[26]。
即使在基础条件下，我们也观察到组蛋白H2AX的广泛磷酸化，这表明存在大量自发的DNA双链断裂（DSBs）。
CRediT作者贡献声明
弗朗切斯卡·切坎蒂（Francesca Ceccanti）：方法学研究。多梅尼卡·迪贝洛（Domenica Di Bello）：方法学研究。马蒂尔德·马泰奥利（Matilde Matteoli）：撰写初稿、数据可视化、方法学研究、数据分析。基亚拉·纳尔多尼（Chiara Naldoni）：撰写初稿、数据可视化、数据分析。奥罗拉·法拉斯基（Aurora Falaschi）：数据可视化、方法学研究、数据分析。西蒙娜·皮亚吉（Simona Piaggi）：方法学研究。芭芭拉·平托（Barbara Pinto）：方法学研究。罗伯托·斯卡帕托（Roberto Scarpato）：撰写、审稿与编辑、概念构思。维罗妮卡·埃斯波斯蒂（Veronica Esposti）：方法学研究。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
我们衷心感谢特伦托大学（University of Trento）综合生物学中心（CIBIO）的亚历山德拉·比西奥（Alessandra Bisio）博士和比萨国家研究委员会（National Research Council, Pisa）的安东尼奥·穆西奥（Antonio Musio）博士慷慨提供HCT116细胞系。作者还感谢IRCCS IST基金会（Fondazione IRCCS IST，米兰，意大利）的安娜·基亚拉蒙特（Anna Chiaramonte）博士、伊莎贝尔·巴特洛尼（Isabel Bartelloni）、丹尼斯·阿卡博（Denise Akabo）、埃莱娜·迪耶诺（Elena Di Ienno）和贾达·巴尔齐（Giada Balzi）在实验过程中的协助。
