犬类呼吸道病原体自动化高通量检测系统的开发与验证

《Frontiers in Veterinary Science》：Automated highly multiplex detection system for respiratory pathogens in canines

本文报道了一种基于巢式PCR技术的自动化多重检测系统（AAMST），可同时检测14种犬类呼吸道病原体（包括病毒和细菌）。该系统通过优化引物探针设计、构建质粒阳性对照，并利用微流控芯片实现全自动化操作（核酸提取、扩增、检测），在90分钟内完成检测，灵敏度达800-4,000拷贝/毫升，特异性良好。该研究为犬传染性呼吸道疾病（CIRD）的快速、精准诊断提供了重要工具，有助于指导合理用药（避免抗生素滥用）和疫情监测。

　　

引言

犬传染性呼吸道疾病（CIRD）是犬类中普遍存在的传染性疾病，其临床症状非特异性，如咳嗽、鼻漏和发热，使得兽医在发病初期难以仅凭临床表现确定致病病原体。早期准确诊断对于预防疾病进展为严重并发症（如肺炎）和广泛疫情暴发至关重要。区分病毒和细菌病因可指导适当的治疗和用药方向，例如避免抗生素滥用。因此，本研究旨在开发一种适用于自动化检测系统的新型多重分子检测方法，该方法采用巢式聚合酶链式反应（PCR）技术，覆盖14种常见犬呼吸道病原体的15个基因靶点，包括犬流感病毒（H3N2、H3N8和H1N1）、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬疱疹病毒、伪狂犬病毒、狂犬病毒、犬腺病毒（1型和2型）、犬冠状病毒、犬支原体、支气管败血波氏杆菌和马链球菌兽疫亚种。

材料与方法

引物和探针的设计

病原体靶点的特定基因组序列从美国国家生物技术信息中心（NCBI）获取。引物和探针在其保守区域内设计。参考基因组序列，外引物用于在第一阶段多重PCR扩增中产生较长的扩增子。这些扩增子随后在第二阶段单重实时PCR中通过内引物和探针的结合进行检测。所有引物和探针的序列均避免形成稳定的二聚体或发夹结构，并拒绝非特异性引物结合以最小化不理想的扩增。设计参数包括外引物具有接近70°C的高熔解温度（T_m），内引物设计为较短长度，因此具有相对较低的熔解温度，接近60°C。荧光探针位于一对内引物之间的靶序列上。

质粒阳性对照的设计

为了验证引物和探针的扩增效率和分析性能，构建了独特的质粒作为阳性模板。使用pUC57质粒克隆载体，该质粒长度约为3.3 kbp，可插入三个靶片段（T1、T2和T3），每个靶片段约550 bp。每个靶片段遵循目标病原体的序列，允许在扩增过程中与设计的引物和探针在指定位置进行互补结合。质粒浓度通过NanoDrop分光光度计测量A₂₆₀值，并转换为每毫升拷贝数（copies/mL）。质粒被连续稀释至2.8 × 10²到 2.8 × 10⁶copies/mL的范围，并在使用前于-20°C储存。

巢式PCR的条件和分析线性

在第一阶段多重RT-PCR中，5 μL样品模板与6.25 μL酶预混液混合。所有外引物（正向和反向）混合在一起加入酶预混液中，终浓度为0.07 μM。用无核酸酶水将反应体积补至25 μL。RT-PCR反应包括在50°C下反转录5分钟。在95°C灭活RT 20秒后，进行PCR热循环：95°C 6秒，65°C 35秒，共26个循环。产物随后用无核酸酶水稀释20倍，然后开始第二阶段单重PCR。在第二阶段单重PCR中，分别为每个面板病原体制备单对内引物（0.5 μM）、FAM探针（0.2 μM）和包含PCR酶（5 μL）和0.2 μM Rox染料的预混液。然后将3.6 μL稀释的扩增子qPCR产物加入每个管中，并在QuantStudio 7 Flex实时PCR系统上进行qPCR。热循环程序设置为95°C 1秒和55°C 45秒，共45个循环。对于分析评估，使用连续10倍稀释的质粒模板（浓度从2.8 × 10⁶到 2.8 × 10²copies/mL），绘制阈值循环（C_T）值与输入模板浓度的线性关系图。

AAMST系统实验

将300 μL样品加载到AAMC微流控芯片中，然后送入AAMA分析仪。通过点击AAMS软件按钮启动测试程序。自动化运行预定义的生物化学协议，无需进一步的人工操作和干预。基本流程包括细胞裂解、核酸提取（即纯化和分离）、巢式PCR、信号采集、数据分析和结果报告。AAMC芯片在生产时已整合了设计的引物、探针和试剂组，并包含定义好的微流控网络。AAMA分析仪配备电子、机械和电热单元，驱动AAMC芯片上的组件。整个过程大约需要90分钟生成结果。

AAMST系统的检测验证

使用从Shengcheng Beina Chuanglian, BNCC购买的灭活病原体进行检测验证，这些病原体具有目标临床病原体的完整基因组序列。灭活样品作为AAMST的输入样品，在使用前储存于-80°C冰箱。

结果

多重巢式PCR中设计的引物和探针的验证

本研究设计的引物和探针首先使用台式程序和设备进行验证，然后再实施到AAMC芯片中。使用包含目标序列的质粒阳性对照（浓度范围2.8 × 10²到 10⁶copies/mL）作为输入模板，进行连续十倍稀释。模板首先经过提取过程纯化和分离核酸，然后依次进行第一阶段带外引物的多重扩增、稀释和第二阶段带内引物和探针的单重扩增。结果显示，所有15个检测靶点均获得了典型的线性标准曲线。展示了令人满意的线性、R平方值（R²）和扩增效率（E）。所有相应的PCR扩增曲线均显示出清晰的标准锐利形状，基线以上平台期明确。在设计过程中，设计了多组引物和探针。那些未能达到满意扩增曲线（如低平台水平和高C_T值）的组合被从检测中淘汰。合格的引物和探针组被应用于AAMC芯片的生产。

AAMST系统的分析灵敏度

为了验证所开发检测方法与AAMST系统的兼容性，使用质粒作为输入模板加载到已整合选定引物和探针的AAMC芯片中。芯片然后在系统中进行处理。典型结果显示，当使用含有CIV、CIV-H1N1和CAdV-1三个靶点的质粒（800 copies/mL）作为输入模板时，扩增曲线一致且特异性地从相应反应室（其互补引物所在位置）获得，而其他反应室则没有曲线。值得注意的是，粟酒裂殖酵母RNA（SUC1）和qPCR对照分别用于第一和第二阶段扩增的过程控制，确保系统运行正常。随后，使用不同浓度的模板（80 copies/mL、800 copies/mL和4,000 copies/mL）测试最低可检测浓度。每个浓度进行三次重复。只有那些在系统所有三次重复中均检测到有效C_T值的浓度才被报告。结果显示，最低可检测浓度（检测限，LOD）对于犬支原体和犬冠状病毒可低至4,000 copies/mL（或4 copies/μL），对于其他13个靶点可低至800 copies/mL（或0.8 copies/μL）。该自动化多重系统产生的这些数值与文献中报道的使用常规PCR检测的相关犬类检测数据相当。在检测过程中，还观察到优异的特异性。该结果验证了设计的引物和探针以及与AAMST系统的良好兼容性，特别是与系统定义的温度曲线和自动化流程配合良好。

使用灭活病原体验证AAMST系统的犬类检测

所提出的自动化检测方法进一步通过使用商业灭活病原体的参考材料进行验证。这些材料被用作相关模型来模拟临床样品，以评估可行性和可用性。将参考材料的不同稀释度以及病原体组合分别应用于输入样品中：马链球菌兽疫亚种、犬腺病毒2型、犬腺病毒1型、犬疱疹病毒1型、犬瘟热病毒、支气管败血波氏杆菌，以及混合样品（包含CIV-H1N1、犬副流感病毒、犬疱疹病毒1型、犬腺病毒2型、犬腺病毒1型、支气管败血波氏杆菌和马链球菌兽疫亚种）。定性结果显示，当从相应病原体检测到有效C_T值时定义为"阳性"。C_T值也可用于估算其定量数量。值得注意的是，C_T值取决于输入材料的浓度。括号中的数值恰当地反映了运行前制备的各种稀释度。对于输入材料中不存在的病原体，相应的PCR室未显示扩增曲线，因此C_T值无法确定，在结果表中以空白单元格表示。在检测含有混合病原体的样品时，结果均与已知输入一致。该结果验证了系统执行多重检测的能力，并展示了多重检测在流感亚型分型（即对CIV和CIV-H1N1均呈阳性）、区分犬腺病毒1型和2型以及检测病原体混合池（即样品中的病毒和细菌）方面的特异性一致性。这与共感染病例高度相关。

讨论

本研究报道了一种用于自动化多重检测与犬呼吸道疾病相关的14种病原体（15个基因靶点）的检测方法的开发和分析验证。本研究实现的检测限（LOD）在8 × 10²到 4 × 10³copies/mL之间，与文献中使用实验室程序报道的其他数据高度可比。同时还获得了优异的特异性，未出现非特异性扩增。这归因于巢式PCR方案的使用。在巢式PCR中，第一轮多重PCR可能会牺牲特异性，导致由于引物的非特异性结合而产生非预期序列的扩增子。然而，这是可以容忍的，因为扩增子随后在第二轮单重PCR中通过新的引物组和额外的探针进行再次验证。因此，可以同时实现多重扩增的检测限和特异性。

在开发过程中，值得指出的是，在将设计的引物整合到芯片上进行验证至关重要。引物不仅要靶向病原体的保守区域，还必须与限制性的温度曲线兼容，并避免与其他引物和序列片段发生不必要的相互作用。通过在设计阶段进行仔细的T_m计算和基因比对可以避免一些失败，但这往往不可靠。通过观察其产生的扩增曲线和C_T值进行实验验证是必不可少的；这尤其可以通过所示的线性关系图来确认。经过此验证后，后续与芯片的整合就变得直接明了。进一步的引物筛选和选择可以依赖于参考材料和临床样品的性能。在未来的研究中，需要通过大量临床样品进行大规模评估，以确定统计学的临床灵敏度和特异性。此外，还需要解决犬类样品基质对检测性能的影响。尽管如此，可以假设其影响与人类样品相似。AAMST系统中的检测方法已很好地接受了人类样品基质。

在治疗共感染时，可以使用抗病毒和抗生素药物的组合。然而，这些药物具有高度的物种和病原体特异性。对于治疗病毒感染，可以考虑使用抗病毒药物，如利巴韦林和干扰素-α；而对于治疗细菌感染，则可以应用抗生素，如多西环素。这是两种截然不同的用药方法。一种药物对某一物种有效，但对另一物种无效。这些药物可能对健康产生潜在的不良影响。应在用药前进行正确的诊断。这有助于预防不必要或不适当的用药以及潜在的伤害。此外，可以精确开具抗生素处方，从而缓解日益受到关注的抗菌素耐药性问题。由于犬呼吸道疾病中经常发生共感染，因此准确检测多种病原体（如本研究开发的检测方法）对于其实施和确定适当的临床治疗方案非常重要。

将方案自动化并封装在芯片内将为用户利用这种有用的分子方法提供便捷的解决方案。相比之下，操作相同协议的实验室工作流程至少需要3小时，包括试剂准备、液体处理以及在仪器之间的转移。而本研究中的操作员在加载样品并开始运行后即可离开系统。结果大约在90分钟内可用。

此外，本研究展示了使用多重检测能力提高检测可靠性的优势。已知CIRD（如流感）具有高突变率。增加检测中的基因靶点可以确保对进化疾病中新突变和变体的充分覆盖。检测限因检测区域而异。例如，在本研究中，检测中包含了针对犬瘟热病毒核蛋白基因和基质蛋白基因的两组引物探针。即使一个基因或另一个基因发生突变，仍然可以检测到犬瘟热病毒。除了犬瘟热病毒靶点外，还可以根据需要在检测中设计并包含针对其他靶点的额外引物探针组。对于流感，鉴定其亚型是有用的，因为特定亚型可能比其他亚型导致更严重的疾病。作为亚型分型能力的演示，成功检测到了使用灭活材料的CIV和CIV-H1N1。总共可以在AAMST系统中整合超过40个检测靶点。该技术可以成为一个有价值的平台。它可以提供非常全面和多功能的检测面板，可转化为研究、临床研究、环境监测和疫情监测等许多领域的应用。

本研究描述的建议设计程序和实验参数对于在自动化AAMST中开发新面板非常重要。清晰的指南可以减少不确定性，从而缩短开发时间。遵循该指南，可以通过整合新的病原体组合和添加，将检测方法开发成许多衍生产品，这取决于不同专家、地区和研究主题的兴趣。预计新面板将对快速变化和新发传染病做出更紧密的响应。全球化将不可避免地加速传染病的传播。由于人与人、人与动物、动物与动物之间互动的增加，它将加速跨物种疾病传播的风险。可以预见，过去从未见过的新病原体将不断出现，并对社会产生巨大的负面影响。因此，面板扩展的能力和便利性对于保持检测面板的最新有效性和全面性至关重要。

结论

本研究开发了一种使用巢式PCR方法的检测面板，可同时覆盖14种常见犬呼吸道疾病病原体。通过遵循提供的设计流程和参数，已成功将其迁移到AAMST系统中，以实现此类复杂协议的自动化。该自动化检测方法已通过分析验证和灭活病原体验证。展示了优异的检测限和特异性。本研究不仅展示了针对犬呼吸道疾病的检测方法的开发，而且将成为开发此类其他多重检测方法的有用参考。