《Frontiers in Genetics》：The value of quantitative fluorescence polymerase chain reaction for the products of conception in the era of copy number variation sequencing
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本研究系统评估了拷贝数变异测序（CNV-Seq）与定量荧光聚合酶链反应（QF-PCR）在流产组织染色体异常检测中的效能，提出先通过QF-PCR排除母体细胞污染（MCC）再进行CNV-Seq检测为最优策略，为临床流产物遗传学检测方案选择提供了重要循证依据。
引言
自然流产指临床确认的妊娠在胎儿具备存活能力前的自然丢失，约15%–20%的临床妊娠以妊娠丢失告终，且多数发生在妊娠早期。妊娠12周前的流产称为早期流产，12–28周间则为晚期流产。导致自然流产的因素包括遗传因素、解剖异常、内分泌紊乱、免疫疾病等，其中胎儿染色体异常是超过50%自然流产的主要原因。
染色体非整倍体、三倍体和致病性拷贝数变异是导致自然流产的主要遗传因素。传统染色体核型分析因失败率高、耗时长、分辨率低等局限性已较少使用。拷贝数变异测序（CNV-Seq）作为新一代测序技术，具有高通量、高分辨率、低成本及低样本需求等优势，可有效检测低至10%的嵌合比例，近年来成为流产物遗传检测的一线方法。然而CNV-Seq无法检测三倍体，且可能检出临床意义不明确的拷贝数变异（CNV），为遗传咨询带来挑战。
定量荧光聚合酶链反应（QF-PCR）基于短串联重复序列，不仅能低成本检测三倍体，还可判断样本是否存在母体细胞污染。研究表明QF-PCR与CNV-Seq联用可提高染色体异常检出率，但文献中联合检测策略存在差异：策略1为所有样本先经QF-PCR排除母体细胞污染后行CNV-Seq；策略2仅对QF-PCR无异常样本行CNV-Seq；策略3先对所有样本行CNV-Seq，再对CNV-Seq判定为正常女性的样本用QF-PCR确认是否为三倍体。
方法与材料
本研究回顾性纳入2022年1月至2024年10月于漯河市中心医院行流产物遗传检测的701例患者。样本经无菌生理盐水冲洗后提取DNA，QF-PCR采用上海库崎医疗科技有限公司生产的试剂盒检测21、18、13号及性染色体非整倍体；CNV-Seq使用Berry Genomics试剂盒建库，在Illumina NextSeq CN500测序仪上完成测序，分析分辨率达100 kb。统计学分析采用SPSS 25.0软件，分类变量比较使用卡方检验或Fisher精确概率法。
结果
样本特征分析显示，701例样本中QF-PCR检出18例（2.57%）存在母体细胞污染。剩余683例样本行CNV-Seq检测，包括523例绒毛样本、74例胎儿组织样本和86例未知组织样本。孕妇平均年龄31.22±4.74岁，高龄产妇（≥35岁）占比23.87%；平均流产孕周9.75±4.07周，早期流产占89.02%；47.58%无流产史，31.63%有1次流产史，20.79%有≥2次流产史；自然妊娠占87.70%，体外受精妊娠占12.30%。
染色体异常分布显示，683例样本中异常检出率达67.20%（459/683）。其中单纯三倍体19例（2.78%），三倍体合并非整倍体4例（0.59%），三倍体合并CNV 3例（0.44%）；单纯染色体非整倍体234例（34.26%），非整倍体合并CNV 58例（8.49%），单纯CNV 141例（20.64%）。
检测效能比较显示，QF-PCR对21三体/18三体/13三体检出率为100%，但对性染色体非整倍体嵌合体检测存在局限：QF-PCR检出58例，CNV-Seq额外检出8例嵌合病例。CNV-Seq还检出183例除21/18/13三体外的其他常染色体三体及4例单体。
临床特征关联分析表明，高龄产妇组非整倍体检出率显著高于低龄组（51.53% vs 40.19%）；随着流产次数增加，非整倍体及总体染色体异常率显著升高；早期流产组非整倍体检出率高于晚期流产组（45.32% vs 27.03%）；自然妊娠组非整倍体及总体异常率均显著高于体外受精组。三倍体与CNV的检出率与上述因素均无显著相关性。
三种检测策略比较显示，策略1（先QF-PCR排除污染后全样本CNV-Seq）检测最全面，总费用230.9万元；策略2（仅QF-PCR异常样本行CNV-Seq）费用197.4万元；策略3（先CNV-Seq后QF-PCR验证）费用190.4万元，但无法排除母体细胞污染。
讨论
本研究染色体异常检出率67.20%高于文献报道，主要因将临床意义未明CNV纳入统计。QF-PCR检测常见非整倍体准确快速，但对低比例嵌合体检测存在局限。母体细胞污染难以完全避免，需同步进行母血QF-PCR验证。
高龄、流产史、早期流产及自然妊娠与非整倍体发生显著相关，而与三倍体、CNV无显著关联。体外受精妊娠因卵胞浆内单精子注射受精和优质胚胎筛选等过程，可能降低染色体异常风险。
三种策略中，策略2和3虽降低成本，但可能漏检部分异常或无法识别母体污染。流产物染色体异常类型多样且常为多重异常，检测策略应优先保证准确性和全面性。
研究局限性包括样本量有限可能产生数据偏倚，且未行父母染色体验证即将临床意义未明CNV归为异常，可能导致异常率偏高。
结论
流产物染色体异常检出率高达67.20%，以非整倍体最为常见。QF-PCR可有效检测母体细胞污染、常见非整倍体及三倍体，是对CNV-Seq的重要补充。高龄、有流产史、早期流产及自然妊娠的流产物更易出现染色体异常。采用QF-PCR排除母体细胞污染后行CNV-Seq检测为最优策略。
