《Frontiers in Immunology》：Making deep immunophenotyping accessible: the successful application of a guided 23-parameter mouse immunophenotyping panel package provided through a shared resource
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本综述由弗吉尼亚联邦大学（VCU）流式细胞术共享资源（FCSR）开发，详细介绍了一种优化的23色小鼠免疫表型分析方案。文章阐述了如何通过共享资源（SR）提供标准化试剂、染色方案、仪器培训及分析模板，显著降低了高参数光谱流式细胞术（如5激光Cytek Aurora?）的应用门槛。该方案具有高度可重复性、成本效益及可修改性，支持传统手动设门与高维分析（如tSNE、uMAP），适用于多种组织类型（如肿瘤微环境TME、血液、脑组织等），旨在助力研究人员轻松进入高维流式分析领域。
引言
随着光谱流式细胞术的进步，高维流式分析对研究人员而言变得越来越容易实现。然而，更高的维度也给面板设计、样本制备、数据采集和分析带来了更大的复杂性。弗吉尼亚联邦大学（VCU）的流式细胞术共享资源（FCSR）开发了一种23色免疫表型分析面板，针对各种小鼠样本类型进行了优化，能够在单细胞水平进行全面的免疫细胞分析。优化的多色免疫荧光面板（OMIPs）是FCSR设施可提供的宝贵资源，该面板的创建基于研究人员的需求，并作为其他机构扩展服务、提供广泛可及性和深度实用性的范例。
方案开发
设计高参数面板对研究人员提出了巨大挑战，特别是在匹配抗原密度水平和荧光团亮度同时最小化光谱重叠方面。VCU的FCSR通过严格优化荧光团选择和面板布局来缓解这些挑战。相似性矩阵和复杂性指数是评估荧光团光谱区分度的重要工具。相似性值接近1表示光谱高度重叠，可能导致扩散误差增加和分辨率降低，这对于共表达的标记物尤其成问题。预测的染色指数损失量化了由于添加荧光团而导致的阳性与阴性信号分离度的损失，较高的值表示分辨率损失更大。扩散不仅受荧光团组合的影响，解混算法本身也会将扩散引入面板。对于这两个矩阵，较高的值都表示分辨率损失更大，因此理想情况下这些标记物应保留在互斥的细胞群体上。
方法应用
尽管现有商业面板（如Cytek?24色小鼠免疫分析面板）可用，但这些可能无法满足所有机构的具体需求，并且通常需要实验室进行大量的前期投资。所述面板首先可以根据每个研究人员的需求轻松修改，其次，通过共享资源（SR）或实验室进行集中管理的抗体库，可以实现批量购买、最佳分装和具有成本效益的已验证试剂获取。该方法进一步减少了浪费，避免了研究人员单独购买大量抗体来优化高参数面板的需要。所述方案的应用为经验不足的研究人员提供了一个易于入门的起点，同时为经验更丰富的研究人员简化了工作流程。为确保分析的一致性和可重复性，可以创建并提供标准化的数据采集和分析模板，以支持从始至终的最佳实践。整个过程旨在帮助SR的新客户轻松进行高参数流式细胞术分析。
5激光Cytek Aurora光谱流式细胞仪允许同时运行多达64个参数，所述面板为每个研究人员的目标准备了足够的定制灵活性。面板的光学布置显示了23种荧光团分别由哪个激光器激发及其最大发射波长。选择荧光团是为了尽量减少发射波长相似的荧光团数量，这有助于减少额外的扩散。一个可定制的选项涉及去除细胞内FoxP3标记物，并用另一种Alexa Fluor 488（AF488）缀合抗体替代。这种替换是有利的，因为AF488可用于大多数商业标记物，并且面板中的其他荧光团与AF488的相似性较低，这意味着额外的标记物可以与原始标记物共表达，而不会导致分辨率损失或扩散。或者，用户有多种选项将新的荧光团添加到现有面板中。表格2列出了一些可以加入而不会显著增加面板复杂性指数的额外荧光团，并注明了最可能发生额外扩散的地方。
为进一步提高分辨率，Cytek Aurora系统支持自身荧光提取，从而改善染色群体的分辨率。虽然VCU的FCSR提供参考对照，但组织特异性自身荧光的可变性会影响信号质量。由于荧光信号是叠加的，拥有合适的背景来从真实荧光信号中减去非常重要，因此鼓励研究人员为每种样本类型制备未染色对照。如图所示，在初始脾脏样本和HyParComp细胞模拟物（HyParComp beads, Slingshot Biosciences）中产生的自身荧光特征低于在血液或酶消化组织中观察到的自身荧光。包含适当的对照可以准确减去自身荧光并提高信噪比。
对于数据分析，所述面板支持传统设门和高维分析，如t随机邻域嵌入（tSNE）和均匀流形近似与投影（uMAP）图生成。高参数分析在研究异质性微环境（如肿瘤微环境TME）时特别强大。进行了手动设门，并将群体叠加在每个tSNE图上。每种肿瘤类型都表现出独特的免疫特征，该面板允许从髓系和淋巴系表征不同肿瘤模型中的不同群体。即使有明确的手动设门，无监督聚类算法对于识别新的群体仍然有用。髓系tSNE群体设门为活CD45+ CD19-和TCRβ- TCRγδ-以排除任何B细胞和T细胞群体，而淋巴系tSNE群体设门为活CD45+ CD11b-细胞以排除大多数髓系细胞。尽管CD11b可用作泛髓系标记物，但仍存在其他CD11b-髓系群体。例如，在TME中存在一些未设门的（灰色）岛屿，但通过利用多图叠加功能进行进一步分析，我们能够看到这些岛屿对面板中的其他群体标记物呈阳性，这可能会被手动设门偏见所忽略。对于髓系群体，通常在下游分析之前对CD11b+细胞进行设门，但如果首先对阳性群体进行设门，可能会错过这些其他CD11b-髓系群体。这证明了手动设门可能存在偏见，特别是对于那些不太熟悉免疫细胞标记物的人。这也强化了“推荐”的设门策略和分析模板只是一个通用示例，应根据每个研究人员的目标进行修改。为帮助减少偏见，降维技术（如tSNE图可视化）可以成为更有用的工具，用于同时查看所有选定的参数和样本，以帮助识别稀有细胞类型。理解和能够调节TME是癌症研究人员的一个主要目标，这种优化的面板使刚接触流式细胞术的研究人员能够立即投入免疫细胞的高参数流式分析，以利于他们的研究目标。
除了肿瘤研究，该面板还适用于血液和各种组织类型。在脑中使用该面板可以识别小胶质细胞以及浸润的免疫细胞，如巨噬细胞和先天淋巴样细胞（ILCs）。在血液中，用户可以区分单核细胞亚群以及T细胞的活化状态。该面板在其他消化组织（如乳腺）中也有效。总体而言，该面板更直接地针对进行探索性免疫细胞分析的研究人员，这允许在识别总体趋势后，将未来的方向集中在更具体的群体上。肝脏驻留巨噬细胞（即库弗细胞）是许多研究人员感兴趣的领域，对该面板进行替换（用APC-TIM4替换APC-KLRG1）和添加（PerCPCy5.5-Clec2）可以区分库弗细胞和浸润的巨噬细胞。总的来说，这些例子强调了该面板在不同组织（包括那些需要复杂解离步骤的组织）中的多功能性。尽管设门的群体可能因实验背景而异，但提供了该面板如何应用于探索性研究中表征不同免疫亚群的一般示例。
材料与方法
设备方面，需要使用配备五激光器（355, 405, 488, 561, 640 nm）和可选自动96孔板加载器的Cytek Aurora分析仪。仪器软件上保存有采集模板，包含所有参考组单色对照，以及为淋巴细胞设置的仪器前向散射/FSC-A和侧向散射/SSC-A检测器；根据需要更改仪器设置，并可以保存在仪器软件中供将来使用。采集模板和FSC-A/SSC-A设置是仪器特定的，应相应修改。
试剂包括Zombie NIR（活力染料）、FACS缓冲液、Fc封闭混合物、主抗体混合物、固定和破膜缓冲液以及FoxP3细胞内混合物。
逐步染色程序从制备抗体混合物和新鲜稀释固定破膜缓冲液开始。制备样本的单细胞悬液，用台盼蓝或类似细胞染色染料计数细胞（建议从每样本1x106个细胞开始）。可选步骤用于额外的“计数”分析，以便计算回总细胞数。染色可在96孔U底板或常规5毫升流式管中进行。所有样本和试剂应始终置于冰上，除非另有说明。程序包括用PBS洗涤、Zombie NIR染色、Fc封闭、表面染色、固定、破膜（如进行FoxP3染色）和细胞内FoxP3染色。固定后的样本可在4°C避光保存长达5天。程序时间取决于样本处理、固定和细胞内孵育时间，总计可能需要数小时至过夜。
数据分析与设门策略
所述面板广泛鉴定髓系和淋巴系免疫细胞群体，包括：树突状细胞（DCs）、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、CD4和CD8 T细胞、调节性T细胞、T γδ细胞、自然杀伤（NK）/NK T细胞、ILCs和B细胞。面板还包括效应和记忆细胞标记物以及功能标记物。建议使用FoxP3的荧光减一（FMO）对照作为T调节细胞的阴性设门对照。
初始白细胞设门在散射和活力上进行，以去除聚集体、双联体和死细胞。从这个清理后的群体中，基于CD45+表达设门白细胞。
髓系亚群：CD45+细胞随后设门为髓系群体，广泛定义为CD11b+。巨噬细胞通过F4/80+表达进一步定义，并可细分为M1样（CD206?）和M2样（CD206+）以及MHCII+巨噬细胞。树突状细胞定义为CD11c+MHCII+F4/80?表达。中性粒细胞可定义为F480-Ly6C-Ly6G+细胞，其他单核细胞可根据Ly6C和Ly6G表达进行分离。在肿瘤样本中，髓源性抑制细胞可分为单核细胞性（Ly6C+Ly6G?）和粒细胞性（Ly6C+Ly6G+）亚群。髓系亚群设门可能非常复杂和细致，因为许多标记物在多种细胞类型上表达。
淋巴细胞亚群：淋巴细胞在F4/80?细胞上设门，因为它们在非特异性结合抗体方面频率高。设门F4/80?细胞后，通过CD19+MHCII+表达分离B细胞。CD19-MHCII?群体随后设门为TCRβ+或TCRγδ+ T细胞。TCRβ群体分为CD4和CD8 T细胞，两者都进一步分为效应（CD44+CD62L?）、记忆（CD44+CD62L+）和初始（CD44-CD62L+）T细胞群体。该面板不包括CD3，而是使用TCRβ和/或CD90.2来定义T细胞群体。CD8和CD4 T细胞也分析PD1、CD127和KLRG1的表达。转录因子FoxP3在面板中是可选的，用于定义CD4+ T调节细胞。
自然杀伤细胞和先天淋巴样细胞：与T细胞设门并行，从CD19-MHCII-群体中，总NK细胞通过CD335+CD49b+/?识别。NK T细胞基于TCRβ表达识别。与T细胞类似，总NK细胞检查PD1、CD127和KLRG1的表达。CD45+设门后，ILCs对谱系标记物（TCRβ/CD19/CD11c/CD11b）呈阴性，并对CD127呈阳性。
注意事项
关键注意事项包括：需要未染色和仅活力染料对照用于解混和自身荧光提取及分析；面板可在4激光Cytek Aurora上运行（需调整）；试剂可提前制备；建议进行细胞计数和可选计数分析；Zombie NIR需在无蛋白介质中染色并需滴定体积；实验需包含未染色对照；应注意细胞沉淀；FMO对照需同样处理但不加FoxP3；设门策略可灵活调整；tSNE生成参数可根据研究兴趣调整，文中示例使用了特定参数和对照样本。
结论
光谱流式细胞术的出现使研究人员能够利用流式细胞术作为高参数单细胞数据分析这一不断扩展领域的重要工具。VCU的FCSR描述的面板例证了SR实验室如何优化定制免疫表型分析面板，在为研究人员节省资金资源的同时仍能获得前沿数据。所述面板还使研究人员能够适应高参数流式细胞术，并获得仪器操作和复杂数据分析的实践经验，这些经验可用于在更受控的实验环境中开发更具假设驱动性的流式细胞术面板。
