《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Clonal replacement by a P1-1/ST3 lineage in pediatric Mycoplasma pneumoniae, Jinan, China, 2021–2024
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本研究通过回顾性基因组学分析揭示了后疫情时代济南地区儿童肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）的流行特征：P1-1/ST3（T1-3R/EC1）谱系在2023-2024年 resurgence 期间实现克隆替换（占比从41.9%升至84.0%），并与重症肺炎比例上升（7.4%→19.9%）及泛基因组中复制/重组/修复功能富集相关。所有菌株均携带23S rRNA A2063G突变导致大环内酯类（macrolide）耐药，但四环素（tetracycline）和左氧氟沙星（levofloxacin）仍保持敏感性，为高耐药地区的临床用药提供了关键证据。
引言
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是儿童和青少年社区获得性肺炎（CAP）的主要病原体，在学龄人群中最高可占病例的40%。其流行病学特征表现为明显的周期性流行模式，通常每3至7年发生一次区域性流行。然而，自2020年初COVID-19大流行开始以来，呼吸道传染病格局发生了改变。包括佩戴口罩、社交距离和学校关闭在内的非药物干预措施（NPIs）不仅减少了SARS-CoV-2的传播，也导致包括肺炎支原体在内的其他呼吸道病原体显著且持续地减少。
这段低暴露时期催生了"免疫债"（immunity debt）假说，该假说认为，自然免疫刺激的减少会增加免疫幼稚个体（尤其是儿童）的数量。随着NPIs的放松，这种累积的易感性预计会引发比通常规模更大的疫情反弹。这一预测在2023年中期开始成为现实，当时欧洲和亚洲的监测系统报告了肺炎支原体感染的延迟性显著再现。
在东亚，特别是在中国，这次再起与一个长期存在的挑战相交织：高流行率的大环内酯类耐药肺炎支原体（MRMP）。十多年来，中国的MRMP率常常超过90%，限制了一线药物（如阿奇霉素）的经验性有效性，并使临床管理复杂化。更具易感性的儿科人群与高度耐药的病原体相结合，创造了一个高风险环境。
材料与方法
本研究为单中心回顾性队列研究，对象是2021年5月至12月、2023年11月至12月以及2024年10月至12月期间入住山东中医药大学附属医院（济南）的≤16岁诊断为肺炎支原体肺炎（MPP）的儿童。共收集798份咽拭子标本（2021年338份，2023年174份，2024年286份）。MPP诊断基于临床症状、肺部影像学和实验室检查。肺炎严重程度根据中国国家卫生健康委员会《儿童社区获得性肺炎诊疗指南（2019版）》进行分类。
所有咽拭子标本首先使用商业实时定量PCR（qPCR）试剂盒进行肺炎支原体筛查。PCR阳性的标本随后使用先前描述的 duplex real-time PCR 方法进行P1-1和P1-2基因分型。接着对所有qPCR阳性标本尝试进行直接多位点序列分型（MLST）。同时，所有PCR阳性标本均接种到补充了Mycoplasma Supplement G的Mycoplasma Broth Base中进行富集培养。
从每个分离株的对数生长期支原体肉汤培养物中提取基因组DNA，使用Illumina NextSeq 2000平台进行全基因组测序，生成150 bp双端 reads，目标深度至少为100×覆盖率。使用SPAdes将高质量 reads 从头组装成草图基因组。使用MLST工具进行MLST分型。通过将质量过滤后的 reads 映射到肺炎支原体23S rRNA基因参考序列（GenBank: X68422.1）来鉴定大环内酯类耐药突变。
研究采用基于全基因组系统发育的六亚支框架（T1-1, T1-2, T1-3, T1-3R, T2-1, T2-2）。将 reads 映射到参考基因组LR214945.1，并在Li等人报告的EC1/EC2定义位点调用SNP。使用Snippy将 reads 映射到肺炎支原体M129（NC_000912）以调用SNP和indel并生成核心基因组比对。使用RAxML推断最大似然系统发育树。使用≤3 SNP和≤11 SNP阈值探索传播集群。使用Panaroo推断泛基因组和基因存在/缺失矩阵。使用eggNOG-mapper对簇成员蛋白进行功能注释。使用BLASTp搜索毒力因子数据库（VFDB）以鉴定毒力基因。通过肉汤微量稀释法测定抗菌药物敏感性。
结果
实验室确认与临床队列中的分离株回收
从2021年到2024年，共纳入798名临床诊断为MPP的儿童。PCR确认率从2021年的47.3%（160/338）上升至2024年的75.9%（217/286），总体确认率为59.8%（477/798）。在477份PCR阳性标本中，共培养出227株肺炎支原体分离株并进行了基因组分析。
近期流行中疾病严重程度的升级
尽管人口统计学特征稳定（中位年龄约7.5岁，性别比例相似），但后COVID时代儿科MPP的临床严重程度有所增加。在三个年度队列中，峰值体温和住院时间逐步上升（38.5→38.8→39.0 °C；7.0→8.5→9.5天）。全身炎症负担也有所增加：CRP在2023年激增，2024年仍高于2021年水平（20.1→47.8→34.7 mg/L），而LDH在2023年达到峰值，2024年下降但仍略高于基线（338→464→349 U/L）。凝血活性上升（D-二聚体 1.05→1.55→1.70 μg/mL），PCT在2023年达到峰值后于2024年下降，但仍高于2021年水平（1.9→2.9→2.3 ng/mL）。中性粒细胞比例稳定，白细胞计数未显示一致的上升趋势。相应地，重症肺炎的比例逐年上升，从2021年的7.4%（25/338）升至2023年的14.9%（26/174）和2024年的19.9%（57/286），表明近期流行中疾病严重程度发生了可测量的转变。
向P1-1/ST3克隆的快速基因型转变
在标本水平上，对PCR阳性咽拭子的直接P1/MLST分型揭示了随时间推移基因型组成的显著变化。2021年，P1-2/ST14和P1-1/ST3以相近的频率存在（48.7% vs 44.5%），ST30占一小部分（5.9%）；而到了2023年和2024年，ST3在分型成功的标本中分别占65.8%和80.1%，ST14则分别下降至30.6%和13.9%。
为了进一步描述再起期间的基因型动态，我们对所有227株培养分离株进行了P1和MLST基因分型。基于分离株的分析显示了优势菌株的快速转变。2021年，肺炎支原体种群是混合的，P1-1（主要为ST3）和P1-2（全部为ST14）以相近的频率（48.8% vs 51.2%）共同流行。到2023年，P1-1/ST3成为优势菌株（63.6%），并在2024年达到84.0%（63/75）。同期，P1-2/ST14下降（2023年33.3%至2024年9.3%），ST3在2021年后未被检测到。结合标本水平的发现，这些模式支持了P1-1/ST3谱系在2023-2024年济南流行期间的克隆扩张。使用EC1/EC2特异性SNP panel，所有141株ST3分离株（全部为P1型1）被归类为EC1，而所有73株ST14分离株属于EC2。因此，济南的后COVID再起反映了P1-1/ST3 EC1/T1-3R谱系的扩张，背景是P1-2/ST14 EC2/T2-2谱系的衰退。
系统发育和基因组证据支持克隆替换
为了研究近期肺炎支原体暴发的基因组流行病学，我们基于所有227株分离株的核心基因组单核苷酸多态性（SNP）构建了最大似然系统发育树。核心基因组树解析出两个主要簇，分别对应P1型1/T1-3R（EC1）和P1型2/T2-2（EC2）谱系，与P1基因型和EC1/EC2克隆分型高度一致。2021年的分离株散布在两个谱系中，包括一小部分缺乏EC1/EC2特征的P1型1分离株，它们形成了一个T1-3-like分支；而2023-2024年的几乎所有分离株都聚集在T1-3R（EC1）谱系内，并形成一个紧凑的、星状簇，符合单一克隆近期快速扩张的特征。
成对SNP距离分布定量地反映了这一模式。2021年，双峰分布表明两个遗传距离较远的谱系共同流行；到2024年，分布坍缩为一个单一的窄峰，大多数菌株对差异小于30个SNP，与高度克隆化的种群一致。这些数据共同表明，由相对同质的T1-3R（EC1）谱系取代了先前共同流行的、更具多样性的谱系（包括T1-3和T2-2），实现了克隆替换。
传播网络分析揭示高度互连的暴发
基于成对SNP的网络显示出强烈的聚类。使用≤3 SNP的严格阈值时，网络分裂成许多小组分（42个簇）和大量单例（n=75），符合短链、局部传播的特征。在更宽松但仍保守的≤11 SNP阈值下，分离株合并为16个簇，其中包括一个占主导地位的超级簇，包含168个分离株（占所有样本的74%）。这种模式表明大多数分离株属于一个在人群中广泛分布的高度同质克隆。对于像肺炎支原体这样进化缓慢、基因组多样性低的病原体，在≤11 SNP阈值下出现如此大的连通组分主要反映了有限的基因组多样性和近期的克隆扩张，并不意味所有连接的病例之间存在直接的流行病学联系。
泛基因组全基因组关联分析（Pan-GWAS）区分T1-3R/T2-2，而粘附素和CARDS毒素保持保守
基因存在/缺失的Pan-GWAS鉴定出37个与支系相关的基因簇（FDR q<0.05），其中19个在T1-3R（EC1）中富集，18个在T2-2（EC2）中富集。将这些簇映射到COG类别揭示了清晰的功能偏向：T1-3R显示出更高比例的注释为"复制、重组和修复"的簇，并且独特地包含"氨基酸转运和代谢"的簇。两个支系都贡献了一个"防御机制"簇，而一个"信号转导机制"簇仅在T2-2中观察到。值得注意的是，两个支系中很大一部分显著簇是"未注释"的（即没有COG分配），T1-3R（EC1）中的比例更高。相比之下，"功能未知"（有COG分配但功能未知）在T2-2中更具代表性。这些模式共同指出了支系特异性在基因组维持和代谢模块上的差异，同时也强调了肺炎支原体中仍有大量基因特征不明。
接下来，我们使用毒力因子数据库（VFDB）调查了227个基因组中的毒力决定因子。在所有227个肺炎支原体基因组中，HMW1（MPN447）、HMW2（MPN310）、HMW3（MPN452）、P1（MPN141）、P40/P90（MPN142）、P30（MPN453）、P65（MPN309）和CARDS毒素（MPN372）在所有分离株中均被检测到。
普遍的大环内酯类耐药与其他抗生素的敏感性形成对比
所有227株分离株均携带23S rRNA A2063G替换，这是大环内酯类耐药的经典标志。未观察到结构域V中其他已知的大环内酯类耐药替换（A2063C, A2063T, A2064C, A2067G, C2617A 或 C2617G）。与这种基因型一致，大环内酯类MICs uniformly high—红霉素>16 μg/mL，阿奇霉素8–>16 μg/mL—远高于CLSI M43-A的敏感临界值0.5 μg/mL。相比之下，四环素和左氧氟沙星的MICs保持在M43-A敏感范围内（分别≤2和≤1 μg/mL）；没有分离株超过这些阈值，表明在该队列中保留了体外活性。
讨论
我们对济南后COVID-19时期肺炎支原体再起的调查揭示，这并非简单的流行病学反弹，而是一次克隆替换。这种选择性清除与更高的临床严重程度指标同时发生，并且发生在一个P1-1/ST3谱系取代先前共同流行变体的时期，这一模式在直接基因分型的PCR阳性标本和培养分离株中均很明显。由于严重程度受许多宿主和护理因素影响，且我们的研究是观察性的，这些平行趋势应被解释为关联性，而非证明ST3谱系本身导致更严重的疾病。高分辨率基因组分析使我们能够将后大流行时期的病原体适应性、宿主免疫和抗菌药物耐药性联系起来。
2023-2024年流行的决定性特征是P1-1/ST3克隆的优势地位，其在直接分型的PCR阳性标本中从44.5%上升至80.1%，在培养分离株中从41.9%上升至84.0%。我们的基因组数据支持这一模式：系统发育树显示近期分离株在T1-3R（EC1）支系内形成一个紧凑的、近乎星状的拓扑结构，并且成对SNP距离从2021年的双峰分布收缩为2023-2024年以T1-3R（EC1）比较为主的单一窄峰。这与近期的克隆扩张一致。为了在更精细的尺度上探索传播，我们构建了基于SNP阈值的网络。在≤11 SNP的截断值下，网络包含大的连通组分。虽然此阈值允许与最近报道的中国流行基因组分析进行比较，但我们谨慎解释这些广泛的簇。鉴于肺炎支原体固有的缓慢替代率和低基因组多样性，这些大连通组分可能主要反映了暴发期间优势T1-3R谱系的一般性扩张，而非所有连接病例间明确的直接人际传播链。相比之下，更严格的≤3 SNP阈值更符合社区内的近期传播，但即使在此范围内的菌株对也可能并不总是代表单步传播事件。
虽然"免疫债"假说解释了可用易感宿主库的扩大，但并未解释为何此特定克隆占优。后NPI环境可能增加了对可传播谱系的选择压力，创造了有利于传播的条件，即使传播优势微乎其微的谱系也能增加频率并取代共同流行的变体。我们的泛基因组分析与潜在优势相符，显示优势T1-3R（EC1）支系富集了涉及"复制、重组和修复"的基因。在北京同时期暴发中观察到类似的P1-1基因型优势，表明这是一种区域模式而非纯局部事件。类似的耐大环内酯类ST3谱系扩张在东亚各地均有报道，ST3 MRMP现在形成了一个主要包含中国、韩国、日本和台湾的东亚亚支。
我们的Pan-GWAS指出了流行支系间的功能差异，而关键的毒力决定因子保持保守。T1-3R（EC1）中复制/重组/修复基因的富集与以下证据一致：肺炎支原体的多样化集中在P1操纵子侧翼的RepMP重复序列周围，基因组内同源重组在此产生亚型连锁的多态性。相比之下，核心末端细胞器组件——P1、P40/P90、P30、HMW1/2/3——在我们的整个数据集中均被检测到，与其在细胞粘附、滑行和细胞形态中的作用一致。所有基因组中均存在CARDS毒素进一步支持了共享的毒力轴：CARDS毒素是一种ADP-核糖基化/空泡化毒素，与气道损伤和炎症有关。综上所述，T1-3R（EC1）可能具有更强的DNA维持能力，同时保留了传播所需的粘附和毒素基因。然而，基因的存在并不等同于毒力。比较"组学"工作显示，尽管基因组高度相似，但CARDS毒素表达存在亚型和菌株特异性差异，并且P1及相关粘附素中重组驱动的抗原和相变可以改变表面暴露和宿主相互作用，强调了进行支系间转录组学和蛋白质组学比较的必要性。
普遍的大环内酯类耐药可能影响了流行的临床影响，即使它并未决定哪个谱系成为优势。所有227株分离株都携带已充分确认的A2063G突变，并且对大环内酯类表现型耐药，这与全中国耐药率超过90%的监测数据一致。在基因组水平上，我们专注于23S rRNA中经典的结构域V突变来定义大环内酯类耐药。然而，最近的全基因组研究表明，其他位点——包括大环内酯类特异性外排泵以及核糖体蛋白L4和其他持家基因的突变——可能与23S rRNA变化共同调节耐药性。对此类次要机制进行系统的全基因组剖析，理想情况下结合定量MIC数据和纵向采样，超出了本研究范围。由于高水平耐药在2023年之前已在P1-1/ST3和P1-2/ST14两个谱系中固定，它并未为克隆清除提供选择性优势。相反，它可能导致较差的临床结局。随着高传播性ST3克隆的传播，普遍的耐药可能降低一线药物阿奇霉素的有效性，并与部分患者发热时间延长、住院时间延长以及进展为重症疾病相关，尽管我们的观察数据不能排除其他因素的混杂，但这促使临床需要转向四环素类等二线药物。所有分离株对四环素和左氧氟沙星的完全敏感性为当前临床实践提供了信息。
本研究说明了将基因组监测纳入公共卫生实践的价值。传统方法可能仅检测到病例数的增加；全基因组测序揭示了克隆替换的潜在机制。该流行克隆的基因组特征——P1-1/ST3, T1-3R（EC1）支系，以及特征性毒力基因谱——可作为高风险谱系的基因组指纹。这支持了前瞻性基因组监测：在新地区追踪此指纹可作为新兴集群的前瞻性标志，从而允许及时发布临床警报和更新治疗指南。这种基因组学指导的策略可能改善后大流行时代的暴发检测和治疗调整。
本研究存在若干局限性。首先，作为单中心回顾性研究，可能存在转诊偏倚，可能过度代表了更严重的MPP病例。第二，所有基因组和基因型-表型分析仅限于227名有培养分离株的儿童（占798例MPP病例的28.5%），因此体外生长不良的谱系和无法回收分离株的患者可能代表性不足，尽管分离株的P1/MLST分布与PCR阳性标本直接分型的结果高度匹配。第三，我们的采样周期在时间上不对称：2021年的分离株是在8个月区间内获得的，而2023年和2024年分别仅贡献了2个月和3个月的采样。由于肺炎支原体流行可在1-2年的波内跨越多个季节，这种不均匀的日历覆盖可能夸大了2021年表观的遗传多样性，并降低了年度间谱系频率和严重程度比较的精确度，尽管所有临床和基因组摘要均按年份分层。第四，尽管我们全程应用了相同的基于指南的重症肺炎定义，但我们并未常规捕获所有病毒和细菌合并感染，并且不能完全排除随时间推移入院或重症监护实践变化的影响。先前的儿科研究表明，与呼吸道病毒或其他细菌合并感染可能加重肺炎支原体肺炎的病程，因此重症病例的增加部分可能反映了未测量的合并感染或临床实践的转变，而非单独由谱系效应引起。最后，观察到的P1-1/ST3基因型与临床严重程度增加之间的关联纯粹是相关的，不应被视为该谱系本身更具毒力的证据；建立因果关系需要前瞻性研究和在适当模型中进行实验验证。
