《Frontiers in Toxicology》：Beyond the amyloid hypothesis: leveraging human-centered complex in vitro models to decode Alzheimer’s disease etiology
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本综述系统评述了阿尔茨海默病（AD）研究范式的转变，重点介绍了脑类器官和器官芯片（OOC）等复杂体外模型（CIVM）在探究病原体感染、环境毒素及肠脑轴（GBA）失调等新兴AD病因假说中的应用价值，为揭示疾病机制和发现新靶点提供了人源化研究平台。
1 引言
阿尔茨海默病（AD）是一种复杂的神经退行性疾病，也是全球痴呆症的主要原因。目前缺乏能够安全有效延缓疾病进展的治疗方法。尽管淀粉样斑块的形成长期以来被认为是疾病发生的主要假说，但越来越多的证据表明，AD的发生可能由多种潜在因素共同驱动，这些因素促进了慢性神经炎症，包括病原体感染、环境毒物以及肠脑轴紊乱。
传统的AD临床前模型，如单层细胞培养和转基因小鼠，难以捕捉人类疾病的复杂性。以人为中心的复杂体外模型（CIVM），包括脑类器官和微流体器官芯片（OOC）技术，通过更接近地再现人脑和疾病机制的关键细胞和分子特征，提供了更高的生理相关性。本文重点介绍了脑类器官和单/多OOC系统等CIVM的最新应用，以及它们如何被用于研究AD病因的新兴假说。
2 CIVMs探索阿尔茨海默病新病因假说及风险因素
2.1 CIVMs探索病原体感染对神经炎症和AD的影响
感染假说认为，病毒、细菌和真菌等病原体可以通过血脑屏障（BBB）进入或持续存在于中枢神经系统内，引发免疫反应。证据表明，病原体感染可能通过触发或加剧神经炎症反应来促进AD发病，最终发展为慢性炎症，伴随小胶质细胞功能障碍，导致突触丢失、神经元死亡和整体认知能力下降。多项研究提示，Aβ本身可能作为一种抗菌肽，通过形成聚集体来捕获入侵的病原体。随着衰老，小胶质细胞清除能力自然下降，淀粉样蛋白生成可能随后出现，表现为斑块积累超过清除能力。
包含神经元和胶质的类器官在暴露于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、人类单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和寨卡病毒（ZIKV）等病毒时，表现出强烈的星形胶质细胞和小胶质细胞活化，导致先天免疫信号通路上调和促炎细胞因子/趋化因子分泌增加。
病毒感染还可在3D人脑类器官中复制AD的关键神经病理学特征，包括在HSV-1和ZIKV处理中观察到的Aβ积累增加和tau蛋白磷酸化。此外，Aβ寡聚体与HSV-1表面糖蛋白结合，导致Aβ产量增加和HSV-1被捕获。在SARS-CoV-2感染中，胶质细胞是人脑类器官中的主要感染细胞类型，小胶质细胞介导的突触吞噬增加三倍。同时也观察到神经元tau蛋白过度磷酸化并易位至胞体，这凸显了类器官模型在解析病毒感染人脑的细胞分子机制及其在AD发病中潜在作用的价值。
微流体系统通过再现关键的生物力学特性（如流速、流体剪切应力、内皮紧密连接的形成），已成为在生理相关条件下模拟BBB的有效工具。由于脂多糖（LPS）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）能够触发神经炎症反应，常被用作模拟感染方面的刺激物。在BBB的脑芯片模型中，两者均与通透性增加相关。LPS处理减少了紧密连接的普遍性，而TNF-α改变了内皮紧密连接标志物的表达，使跨内皮电阻降低约十倍，并增加细胞因子产生，所有这些都导致BBB渗漏。重要的是，BBB损伤和脑血流受损已被描述为导致AD的神经退行性变的早期病理学特征。
在包含人微血管内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元的多室芯片中，HSV-1感染诱导了BBB通透性增加、促炎细胞因子产生和神经元-胶质细胞凋亡。类似地，SARS-CoV-2感染扰乱了BBB稳态，降低了神经血管细胞的活力，并引发 prolonged 促炎反应。人脑芯片系统也适用于评估抗病毒疗法，其中一些可能具有AD治疗潜力。
2.2 CIVMs探索环境污染物对神经退行性变和AD的影响
空气、水和土壤污染物等环境毒物在全球普遍存在，人类长期暴露对其长期神经健康构成重大风险。体外和体内研究证据表明，它们能够破坏神经细胞稳态。多项研究中也观察到过度磷酸化tau和Aβ的积累，表明慢性毒物诱导的神经病理学可能促进AD的发展。鉴于这些不良细胞事件的复杂性和内在相互关联性，CIVMs为从机制上阐明环境毒物如何促成神经退行过程提供了与人相关的研究平台。
镉是工业排放物和磷肥中常见的重金属污染物，在人胚胎干细胞（hESC）来源的脑类器官中诱导急性神经炎症反应，表现为广泛的胶质细胞活化和IL-6产生增加。
柴油颗粒物（DPM）是内燃机产生的主要环境空气污染物，hiPSC来源的脑类器官暴露于DPM会导致神经元电生理信号改变、突触损伤以及炎症标志物增加，这些都与AD相关。
全氟和多氟烷基物质（PFAS），也称为“永久化学品”，包含超过700万种合成有机氟化合物，广泛用于增强商业和工业产品的防水、防油和耐热性。它们已普遍存在于全球水源中，有些在人体内的半衰期超过8年。在hESC来源的脑类器官中慢性暴露于PFAS超过35-70天，增加了tau磷酸化和Aβ积累。
最后，微塑料在陆地和水生生态系统中的普遍存在已成为全球关注的话题，引发了对其潜在神经毒性的疑问。hiPSC来源的脑类器官暴露于微塑料珠（50–100 μm）三周后，细胞活力和胆碱能相关的乙酰胆碱水平显著降低，表明神经元信号中断和潜在的突触功能障碍。
环境毒物也可以被引入微流体“脑芯片”系统以研究其神经病理学机制。在包含人脑内皮细胞、神经元和胶质的模型中，DPM暴露诱导了tau过度磷酸化、Aβ积累、神经元细胞死亡和星形胶质细胞增生，同时伴有小胶质细胞活化和活性氧（ROS）的过量产生。
在发达国家，人们通常80%–90%的时间在室内度过，室内空气颗粒物（PM）也是慢性污染物暴露的重要来源。研究人员用从中国武汉非吸烟居民家中采集的室内纳米级PM处理了一个由星形胶质细胞和内皮细胞组成的人BBB芯片模型。他们证明室内纳米级PM穿过内皮屏障，诱导星形胶质细胞异常增殖和ROS产生升高，同时降低了整体细胞活力。这凸显了环境室内PM暴露对慢性神经炎症发展的惊人影响。
2.3 CIVMs探索微生物群和肠脑轴改变对AD发病的影响
肠脑轴（GBA）是一个双向通讯网络，连接中枢神经系统与肠神经系统、胃肠道和肠道微生物群。信号通过代谢、免疫和神经通路传递，GBA的稳态支撑着正常的生理功能。GBA紊乱可能通过微生物失调（如促炎细菌类群增加）产生，并且越来越多地与神经退行性过程相关联，包括神经炎症、Aβ沉积和tau病理。
应用3D人脑类器官模拟GBA仍处于早期阶段。一种有前景的策略是使用transwell系统，该系统允许囊泡运输和分子跨半透膜扩散。将hiPSC来源的脑类器官与混合的致病微生物群共培养，导致神经元活力降低、AD相关基因上调以及类器官结构完整性的破坏，反映了肠道菌群失调如何促进神经退行性变。其他提出的基于类器官的GBA模型包括将脑类器官直接暴露于肠道微生物群条件培养基，或将脑类器官和肠道类器官在transwell系统中共培养，中间用内皮细胞层隔开以模拟BBB。
单通道和多通道OOC微流体系统正越来越多地应用于模拟GBA，其中欧盟委员会资助的MINERVA项目（授权协议ID：724734）是一个重要里程碑。该项目整合了五个相互连接的hiPSC来源的OOC模块（微生物群、肠上皮、免疫系统、BBB和大脑）以重现沿GBA的通讯。其他使用人源细胞的微流体模型也已建立，用于研究外泌体跨BBB的运输。值得注意的是，来自益生菌Lactobacillus casei和L. plantarum的外泌体和代谢物被证明可以促进突触可塑性，提示了微生物源因子在缓解神经退行性过程方面的治疗潜力。尽管在AD相关机制的直接应用方面有限，但这些微流体GBA平台为在受控且与人相关的条件下研究微生物群介导的神经炎症和淀粉样蛋白生成机制奠定了基础。
3 讨论
尽管投入了数十年的研究，可用于管理AD的药物数量仍然有限，其中大多数仅提供症状缓解，并且仅使一小部分患者受益。最近批准的靶向淀粉样蛋白的抗体标志着向疾病修饰疗法迈出了重要一步。然而，这些治疗主要适用于早期AD或轻度认知障碍患者，并且它们不能治愈，携带自身的风险和局限性。
新的假说已经出现来解释AD复杂的发病机制，在设计新的治疗和预防策略时应予以考虑。这一点尤其重要，因为近一半的痴呆症病例可以通过解决可改变的风险因素来预防。
AD药物开发历史上高失败率可能源于过度依赖简化论的疾病假说和不充分的临床前模型，包括转基因动物和过于简单的体外系统。新兴的以人为中心的模型现在提供了强大的工具来阐明风险因素在触发和加剧神经退行性变和AD中的作用。特别是在动物实验仍然占显著地位的AD研究领域，CIVMs一直处于近期范式转变的前沿，即更广泛地采用以人为中心和非动物的方法论，以推动进展并提高临床前研究结果的可转化性。
CIVMs在细胞和分子水平上模拟人类生物学的增强适用性，逐渐使得对AD病因的新假说进行全面研究成为可能。这些包括对病原体的神经炎症反应、环境毒物的影响以及沿GBA的相互作用，这些越来越被认为是神经退行性变的潜在驱动因素。正如本综述所述，以人为中心的CIVM，特别是脑类器官和OOC系统，可用于探索这些新的病因假说。
每种模型都有其优点和缺点。CIVMs具有患者特异性的潜在优势，保留了支持个性化和精准医疗方法的个体（表观）遗传特征。虽然它们有望克服动物和简单体外模型的限制，但技术优化对于实现其全部潜力仍然至关重要。例如，脑类器官模拟的是早期大脑发育而非衰老的大脑，因此它们与年龄相关神经退行性变的相关性仍不确定，需要通过互补方法进行严格验证。此外，缺乏血管化会导致内部缺氧和细胞应激，从而导致坏死和细胞亚型特化受损。CIVMs还面临由于生物变异性、有限的标准化和可扩展性以及报告不佳导致的再现性问题，阻碍了其被工业界验证和采用。
尽管存在这些局限性，欧盟、美国及其他地区的立法越来越多地支持在药物开发中整合非动物方法，标志着向以人为中心的研究的更广泛转变。
最近证据表明，动态培养条件可以显著提高体外模型的生理相关性。例如，与静态培养相比，基于灌注的系统通过增强营养输送、废物清除和生物力学线索，能更好地重现体内血管化。类似地，氧合已被确定为类器官活力和成熟的关键决定因素，氧气供应不足会显著损害脑类器官的细胞健康并破坏正常组织发育。此外，外源力和时空动力学的变化会影响脑类器官的细胞组成和代谢参数，从而影响突触发生以及特化神经元细胞和胶质细胞的比例，这些是忠模拟神经退行性疾病和AD的关键终点。总之，这凸显了微环境参数对于维持复杂3D培养物中的稳态和病理生理过程至关重要。因此，不仅必须系统地优化CIVM培养参数，还必须实施对这些测试系统的严格、纵向表征。这种表征应包括对培养条件、细胞活力和疾病相关生物标志物的定量评估，以确保再现性和预测有效性。
为了增强再现性，已经引入了适合目的指南以促进CIVM的一致性能。此外，已经提出了体外模型（包括类器官和微生理系统）的最低报告标准，以提高安全性和监管评估的研究质量，同时也与基础和转化研究以及药物疗效测试相关。
我们承认本研究有两个主要局限性。首先，由于字数限制，仅考虑了使用类器官和OOC模型的研究，而其他CIVM如共培养模型也可能相关。其次，出于同样原因，我们专注于关于AD发病机制的选定假说，同时认识到CIVM也已用于研究本综述未涉及的其他病因假说。
4 结论与未来展望
CIVMs在AD研究中正发挥着越来越关键的作用。它们重现人脑生理学和病理学关键方面的能力，为深化我们对AD发病机制的理解提供了前所未有的机会，包括遗传、分子和环境风险因素的贡献。
现代研究越来越多地将CIVMs与先进的计算方法、人工智能和数字孪生技术相结合，以整合和解释快速扩展的生物学和临床数据，从而加速靶点发现和药物开发。这种整合框架在揭示新疾病机制和优化与人相关的治疗干预方面具有巨大前景。
未来的研究应侧重于梳理风险因素和合并症之间的相关性与其因果关系，以更精确地识别直接驱动神经退行性变和AD发病的病原体和环境因素。在分子和细胞水平阐明这些因果通路对于制定有效的预防和治疗策略至关重要。这些努力应以更广泛地采用以人为中心的CIVM和其他新方法学为基础，这些方法可以提高可转化性，减少对动物模型的依赖，并实现对AD研究、预防和治疗开发的真正以患者为中心的方法。
