《Food & Function》：Lactobacillus fermentum remodeled the lung microbiota by crosstalk with the gut and lungs and regulated the PI3K–AKT pathway to alleviate acute lung injury
编辑推荐：
本刊推荐：本研究深入揭示了益生菌发酵乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum）通过肠-肺轴双向调控缓解脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）的新机制。研究发现，口服发酵乳酸杆菌不仅能修复肠道屏障、调节肠道菌群，还能远程重塑肺部微生物组成（增加乳杆菌科丰度），并通过调控鞘脂代谢和下调PI3K–AKT信号通路，显著减轻肺部炎症细胞浸润和上皮损伤。体外肺类器官实验进一步证实其无细胞上清液（CFS）可直接抑制肺泡上皮细胞自身炎症反应。该研究为益生菌干预急性肺损伤提供了坚实的多组学证据和新的治疗策略。
引言
急性肺损伤（ALI）是一种由多种病因触发的急性炎症性肺损伤综合征，可导致肺不张、长期低氧血症、严重呼吸窘迫和高死亡率。越来越多的证据表明，肠道菌群参与调节肺部免疫，肠-肺轴在肺部疾病中起着关键作用。本研究主要目的是探讨发酵乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum）对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤的影响。
发酵乳酸杆菌减轻炎症并保护肺屏障功能
通过单次给予LPS成功建立了稳定的急性肺损伤模型。研究发现，发酵乳酸杆菌灌胃21天对小鼠体重无不良影响，但在LPS诱导后，LF组（发酵乳酸杆菌处理组）的体重下降速度较LPS组更慢。与LPS组相比，LF组的肺湿干重比（W/D）显著降低，表明肺水肿减轻。支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总蛋白浓度、细胞总数和乳酸脱氢酶（LDH）活性在LF组均显著改善，提示肺泡屏障在发酵乳酸杆菌干预后得到修复。肺组织H&E染色显示，LPS组小鼠肺泡和间质有弥漫性炎症细胞浸润，肺泡壁和间质增厚，正常肺结构严重破坏或消失。而LF组肺组织病理学明显改善，损伤评分更低，肺泡壁更薄，炎症细胞浸润减少。这些结果表明，发酵乳酸杆菌能够减少炎症细胞浸润和肺水肿，保护肺屏障功能。
在炎症因子方面，发酵乳酸杆菌显著降低了LPS引起的急性炎症反应。在BALF中，LF组的IL-1β和IL-6水平显著降低。在血清中，LF组的IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP1水平也显著低于LPS组。此外，肺组织F4/80和髓过氧化物酶（MPO）的免疫组化分析显示，发酵乳酸杆菌干预显著改善了LPS诱导的肺部巨噬细胞和中性粒细胞聚集。
发酵乳酸杆菌改善肠道屏障功能并调节肠道代谢
通过检测血清LPS结合蛋白（LBP）浓度来反映肠道通透性。与NC组（正常对照组）相比，LPS组血清LBP水平显著升高，而LF组则显著降低。研究人员检测了结肠组织中闭锁小带蛋白1（ZO-1）、黏蛋白2（MUC-2）和Occludin等典型肠道屏障因子的mRNA表达水平。在mRNA水平上，与NC组相比，LPS组结肠组织中MUC-2、Occludin和ZO-1的相对mRNA表达显著下调。发酵乳酸杆菌灌胃有效逆转了这一趋势，上调了这些基因的表达。通过免疫荧光检测ZO-1、MUC-2和Occludin的蛋白表达，发现发酵乳酸杆菌干预后，肠道黏膜的紧密连接结构和黏液层厚度得到恢复。
代谢组学分析表明，LPS诱导显著改变了肠道代谢。与LF组相比，LPS组脂质代谢物升高，包括多种鞘脂和心磷脂，这些变化提示肠道细胞膜屏障受损。此外，灵芝酸、肉桂醇C等代谢物水平升高反映了LPS组肠道损伤的代偿性增加。发酵乳酸杆菌干预后，肠道屏障得到修复，肠道炎症减轻，肠道免疫激活趋于平衡。
发酵乳酸杆菌恢复LPS诱导的急性肺损伤中的肠道菌群
肠道菌群在结构和丰度上表现出显著异常。在α多样性方面，LPS组的Chao1指数和Shannon指数显著降低。β多样性的主坐标分析（PCoA）也揭示了LPS组的异常。补充发酵乳酸杆菌后，LF组肠道菌群组成结构向NC组转变。在菌群丰度上，与LPS组相比，LF组中毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的相对丰度增加。线性判别分析（LDA）显示，与NC组相比，LPS诱导了红螺菌目（Rhodospirillales）、颤螺菌科（Oscillospiraceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）和坦纳菌科（Tannerellaceae）等菌群丰度的增加。与LPS组相比，LF组增加了厚壁菌门（Firmicutes）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）以及利吉乳杆菌属（Ligilactobacillus）等菌群的丰度。
发酵乳酸杆菌重塑肺部微生态并调节肺代谢
肺部菌群也观察到明显的组成差异。在α多样性方面，LF组的Chao1指数与其他两组有显著差异；β多样性的PCoA分析显示LF组与其他两组显著分离。这些结果表明，补充发酵乳酸杆菌引起的肠道菌群变化同时影响了肺部菌群的物种结构和丰度，构建了一个新的肺部微生物系统。物种丰度柱状图显示，LF组肺部乳杆菌科（Lactobacillaceae）的丰度增加。LEfSe分析表明，与NC组相比，LPS组增加了食酸菌属（Acidovorax）等菌群的丰度；与LPS组相比，LF组增加了肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、假单胞菌目（Pseudomonadales）、乳杆菌目（Lactobacillales）、侧孢乳杆菌属（Latilactobacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）等菌群的丰度。此外，拟杆菌科（f_Bacteroidaceae）、拟杆菌属（g_Bacteroides）和坦纳菌科（f_Tannerellaceae）在LPS组的肺部和肠道中丰度均有所增加。
同样，LPS和发酵乳酸杆菌也引起了肺部代谢物水平的变化。与LF组相比，LPS组下调的肺部代谢物主要是参与细胞凋亡和炎症的鞘脂信号分子，包括多种鞘脂，如SHexCer14:3; 2O/12:1; O, SL17:0; O/15:0; O等，这些鞘脂的耗竭可能损害肺屏障功能和信号转导。作为重要的趋化因子，白三烯B4（LTB4）的减少可能与免疫细胞向肺部的募集受阻或耗竭有关。氨基酸及其衍生物（如鸟氨酸-CA、His–Ser–Lys–Lys）的减少可能反映了肺功能代谢能力的下降。氧化应激产物3-胍基丙酸（3-guanidinopropanoate）的显著上调进一步表明LPS通过氧化应激导致肺损伤。
发酵乳酸杆菌调节LPS诱导的肺损伤中的肺转录组
肺组织转录组分析显示，不同组别在主成分空间中有显著分离，LPS组和LF组在基因表达上存在显著差异。维恩图显示共检测到4888个基因。比较LPS组和LF组，发现LPS组有485个基因上调，1139个基因下调。这些基因通过KEGG通路数据库进行注释，识别出13个显著富集的信号通路。其中，与疾病相关的通路包括PI3K–AKT信号通路、TGF-β信号通路、黏着斑、细胞外基质-受体相互作用、补体和凝血级联反应、吞噬体以及血小板活化等。通过映射PI3K–AKT信号通路中的关键基因，研究人员检测到在LPS组中显著表达的关键基因，包括Tnc、Fn1、Fgfr1、Areg、Ntrk2、Thbs1、Cdkn1a、Myc和Ngf。其中，显著上调的基因Fn1、Thbs1、Areg、Ntrk2和Ngf激活了PI3K–AKT/NF-κB信号通路，促进了炎症因子浸润和肺泡上皮屏障损伤。RT-qPCR结果显示，LPS组PI3K、AKT、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和NF-κB的mRNA相对表达量显著上调，而在LF组中显著降低。
相关性分析显示，乳杆菌科与鞘脂呈正相关，而坦纳菌科与鞘脂呈负相关。PI3K–AKT通路基因Ntrk2和Myc与鞘脂、肺部菌群以及炎症损伤因子显著相关。这些结果表明，发酵乳酸杆菌干预通过肠-肺轴串扰增加了肺部乳杆菌科的丰度，影响了鞘脂代谢，调控了PI3K–AKT通路基因，从而改善了LPS诱导的肺组织细胞损伤。
发酵乳酸杆菌无细胞上清液（CFS）保护肺类器官免受LPS损伤
体外实验表明，LPS诱导后，肺泡类器官发生显著变化，分泌的IL-6和TNF-α水平显著增加。经CFS干预后，IL-6和TNF-α水平确实降低。结果表明，LPS组肺泡上皮类器官中PI3K、AKT、NF-κB和TNF-α等相关基因的mRNA相对表达水平显著增加。CFS干预后，这些mRNA的表达水平下降。发酵乳酸杆菌的CFS改善了LPS诱导的肺泡类器官的急性炎症反应。
在组织形态上，对照组肺类器官呈现完整的类器官结构，具有规则的圆形或椭圆形空腔，内表面光滑，上皮细胞紧密单层排列，细胞核形态规则、大小均匀。LPS组则观察到明显的空腔扩大、上皮层增厚、细胞排列紊乱、核固缩和炎症细胞浸润等典型病理特征。免疫组化染色显示，肺泡类器官中TNF-α的表达显著增加，提示明显的炎症反应。而LPS-Ls组（CFS预处理组）的类器官形态显著改善，细胞变性、坏死和炎症反应也显著减轻。F4/80的表达在LPS组与LPS-Ls组和对照组之间无显著差异，表明肺类器官中未发生巨噬细胞的自发分化。LPS可直接驱动肺泡上皮细胞引起细胞损伤和炎症反应，而发酵乳酸杆菌的CFS可抑制上皮细胞的炎症反应。免疫荧光染色显示，对照组和LPS-Ls组的细胞质和细胞膜呈现弱绿色荧光（p-AKT），而LPS组的细胞膜和细胞质呈现弥漫性增强的绿色荧光，且LPS组的红色荧光（PI3K）略强于LPS-Ls组。这些结果表明，发酵乳酸杆菌的CFS可以抑制LPS诱导的肺类器官中PI3K–AKT通路的过度激活。
讨论
本研究揭示了发酵乳酸杆菌通过协调调控肠-肺轴、肺部微生态和上皮炎症信号来减轻急性肺损伤的多层次保护机制。首先，急性肺损伤引起了急性炎症反应、肠道屏障完整性严重破坏以及肠道菌群改变，这些均被发酵乳酸杆菌有效逆转。其次，发酵乳酸杆菌重塑了肺部菌群，特别是增加了乳杆菌科的丰度，调节了肺部转录和代谢，改善了上皮损伤和炎症细胞浸润。第三，发酵乳酸杆菌的无细胞上清液富含微生物代谢物，可直接通过抑制PI3K–AKT激活来保护肺泡类器官免受LPS损伤。这些数据共同为理解急性肺损伤中微生物调控、代谢和上皮免疫之间的机制联系提供了框架。
急性肺损伤引发了一个炎症和微生物失衡的循环，其特征是炎症介质升高、肺泡上皮损伤和富含蛋白的渗出物增加。严重的炎症反应导致肠道屏障功能障碍，使微生物及其代谢物能够穿过屏障进入肺部，从而进一步激活远端肺黏膜的免疫反应。上皮屏障由一系列蛋白质复合物（如紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1）连接，是维持肠-肺结构稳定和免疫稳态的重要组成部分。与本模型一致，我们的研究发现LPS攻击后紧密连接蛋白表达下降和全身性炎症增加。重要的是，灌胃发酵乳酸杆菌恢复了屏障蛋白水平并改善了循环LBP，表明其主要作用机制涉及稳定黏膜完整性和减少全身性渗漏。
本研究一个值得注意的发现是发酵乳酸杆菌干预后肺部乳杆菌科丰度的增加。虽然肠-肺微生物通讯已被广泛认识，但肠道益生菌直接调控肺部微生态的机制仍不清楚。研究证实，肠道来源的益生菌调控的肠外组织细菌与代谢网络存在显著相关性。在LPS诱导的脓毒症模型中，发酵乳酸杆菌预处理通过抗氧化作用和降低TNF-α、IL-6等促炎因子来保护器官损伤。肠道微生物产物可穿过肠道上皮细胞，通过调节肠道激素直接或间接影响远端器官。共生菌可以稳定地迁移到全身各组织，但具体机制尚不清楚。一些研究认为，高细菌负荷可能促进某些细菌从肠道转移到肠系膜淋巴结，或通过树突状细胞产生的细胞外囊泡进入循环并运输到远端器官。我们的研究结果表明，微生物来源的代谢物或免疫调节信号可能到达肺部并重构局部微环境，从而增强对上皮损伤的抵抗力。这种肠道来源的肺部菌群调控代表了肠-肺相互作用的一个新方面，可能部分解释了在肺组织中观察到的显著变化。
肠道菌群产生的代谢物可通过肠-肺轴传递到肺部，参与肺部疾病的发病机制。鞘脂是细胞膜的结构成分，通过内源性脂质调节肺黏膜免疫，同时发挥旁分泌作用以防御病原体和缓解炎症。在肺炎患者和LPS诱导的急性肺损伤动物模型中，鞘氨醇水平显著紊乱，急性肺损伤的发生发展与鞘脂代谢通路显著相关。因此，调节鞘脂代谢已成为一种有前景的治疗策略。类二十酸是由20碳多不饱和脂肪酸通过环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素P450途径氧化产生的高活性脂质介质。它们通过G蛋白偶联受体或核受体局部发挥作用，广泛参与胃肠道炎症、免疫反应及生理病理过程。在发炎的肠道黏膜中，来源于花生四烯酸的类二十酸（如PGD2、PGE2、TXA2和LTB4）水平升高，这些物质与疾病活动性或严重程度相关。此外，代谢组学结果揭示了三萜类及其衍生物的变化。三萜类及其衍生物具有免疫调节活性，并显示中性粒细胞弹性蛋白酶抑制作用。发酵乳酸杆菌干预引起了肠道和肺部代谢网络的广泛重编程。
PI3K/AKT信号通路是调节代谢和炎症反应等关键生物学过程的重要细胞内通讯枢纽。大量证据支持其在急性肺损伤发病机制和治疗中的关键作用。例如，荆防颗粒可通过抑制PI3K/Akt/mTOR轴及调节相关碳代谢通路来减轻急性肺损伤小鼠的肺水肿和炎症。另一项研究中，急性臭氧暴露通过PI3K/AKT信号激活TRPA1，进而破坏线粒体功能，诱导支气管上皮损伤和铁死亡。此外，该通路与其他代谢过程存在显著串扰；值得注意的是，鞘脂代谢被确定与PI3K信号通路密切相关。体内外研究进一步证实，在急性肺损伤干预中，PI3K/AKT是巨噬细胞极化（特别是平衡M1/M2a表型）的核心调节因子。这与我们的发现一致。发酵乳酸杆菌表现出双重保护作用：全菌调节全身免疫以减少肺部巨噬细胞浸润，而其无细胞上清液则直接靶向肺泡上皮，抑制PI3K–AKT驱动的炎症信号。
关键的是，我们使用无巨噬细胞的肺泡类器官进行的体外实验结果表明，单独使用LPS即可直接激活上皮细胞内的PI3K–AKT信号，提示上皮自身炎症是损伤的主要驱动因素，与免疫细胞募集无关。例如，一项研究表明，肺部部分琥珀酸盐来源于肠道，它可通过促进巨噬细胞极化和PI3K/AKT/HIF-1α信号通路加重肠缺血-再灌注损伤引起的急性肺损伤。无细胞上清液处理有效抑制了PI3K–AKT激活并减少了炎症介质的分泌，证实益生菌来源的代谢物可直接作用于上皮细胞。结合体内研究结果，这些观察支持了一个统一的模型：发酵乳酸杆菌减少了来自肠道的全身性炎症输入，重塑了肺部微生态，并直接调节上皮内信号，这些共同促进了肺损伤的缓解。
本研究存在一些局限性。首先，发酵乳酸杆菌经口灌胃后从肠道易位到肺部的确切机制尚待完全阐明。其次，虽然肺部代谢组学分析表明发酵乳酸杆菌干预后鞘脂代谢发生显著改变，但导致这些变化的具体代谢物尚无法最终确定。此外，由于发酵乳酸杆菌需要酸性生长条件，无法与肺泡类器官直接共培养，从而无法直接观察它们的相互作用。尽管使用低浓度无细胞上清液作为发酵乳酸杆菌的替代物获得了类似的验证结果，但可能低估了发酵乳酸杆菌的全部效应。
总之，发酵乳酸杆菌不仅能调节全身免疫、改善巨噬细胞和中性粒细胞浸润，还能抑制肺泡上皮细胞的自身炎症反应。此外，发酵乳酸杆菌能重塑肺部微生态，影响鞘脂代谢，并抑制PI3K–AKT信号通路，从而减轻肺损伤。这些发现不仅加深了我们对益生菌介导的急性肺损伤保护机制基础的理解，也为开发发酵乳酸杆菌作为潜在辅助治疗剂提供了坚实的临床前证据。
