依来曲普坦氢溴酸盐降解产物的UHPLC–MS、HRMS和2D-NMR结构解析新应用及其降解途径研究

《Biomedical Chromatography》：Novel Application of UHPLC–MS, HRMS, and 2D-NMR for Structural Elucidation of Eletriptan Hydrobromide and Its Novel Degradation Products

本文开发了一种稳定性指示超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC–MS）方法，系统研究了依来曲普坦氢溴酸盐（ELE）在ICH推荐的强制降解条件下的行为。研究首次分离并利用高分辨质谱（HRMS）和二维核磁共振（2D-NMR）完整表征了其在酸性和氧化条件下产生的四种降解产物（DPs），其中包括一种新颖的二聚体。所建立的8分钟UHPLC–MS方法分离度好、灵敏度高，适用于常规分析。该研究填补了先前文献中ELE降解产物结构未知的空白，为改进其质量控制与长期稳定性评估提供了关键科学依据。

　　

引言

为了阐明药物的固有稳定性，强制降解研究通常是药物开发策略的重要组成部分。这些研究在比长期稳定性测试更剧烈的条件下进行，有助于建立合适的分析方法和识别药物降解途径。依来曲普坦氢溴酸盐（ELE）是一种相对较新的5-HT_1B/_1D受体激动剂，用于治疗急性偏头痛。其化学名为3-{[(R)-1-甲基-2-吡咯烷基]甲基}-5-[2-(苯基磺酰基)乙基]吲哚氢溴酸盐。尽管已有文献报道了ELE在人体血浆中的定量分析和制剂含量测定方法，但其化学和物理稳定性，特别是在强制降解条件下的行为，尚未有系统研究。因此，本研究旨在对ELE进行全面的强制降解分析，并对其降解产物进行结构表征。

材料与方法

化学品与仪器

ELE原料药由海得拉巴的一家制药组织馈赠。实验所用试剂，如乙腈（HPLC级）、三氟乙酸、甲酸（LCMS级）、过氧化氢、盐酸、氢氧化钠和DMSO-d₆（NMR级）均购自默克印度有限公司。实验用水为Milli-Q超纯水。

分析仪器包括配备Acquity UHPLC前端的Waters单四极杆质谱仪（SQD2）和MassLynx 4.2软件，用于UHPLC–MS分析；制备型HPLC系统（Waters 2545二元泵模块，2707自动进样器，2489紫外检测器）用于分离降解产物；Bruker Advance Neo 400 MHz核磁共振波谱仪，配备5 mm BBO探头和Z梯度匀场系统，用于1D和2D NMR实验；Thermo Q Exactive轨道阱高分辨质谱仪用于HRMS分析；岛津IRAffinity-1S傅里叶变换红外光谱仪用于FT-IR分析。

UHPLC–MS方法开发

色谱条件经过优化，最终采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 × 2.1 mm, 1.7 μm），流动相A为含0.05% TFA的水溶液，流动相B为含0.05% TFA的乙腈溶液，流速0.4 mL/min，柱温50°C。梯度程序为：0分钟/10% B，6分钟/35% B，8分钟/100% B，8.1分钟/10% B。该方法在8分钟内实现了ELE及其所有降解产物的良好分离，峰形和分辨率俱佳。

强制降解样品制备与纯化

根据ICH稳定性指南（Q1A(R2), Q2(R1), Q3B(R2)），对ELE进行了酸性、碱性、中性水解、氧化、热和光解降解研究。结果表明，ELE在中性、碱性、热和光解条件下非常稳定，未产生降解产物。显著的降解仅发生在酸性（1 M HCl，60°C回流48小时）和氧化（30% H₂O₂，室温48小时）条件下。酸性水解产生一个主要降解产物（DP-4），氧化降解产生三个降解产物（DP-1, DP-2, DP-3）。使用制备型HPLC（Gemini NX C18, 5 μm, 250 × 30 mm柱，流动相为含0.1% TFA的水和乙腈）对降解产物进行分离，收集的馏分经冷冻干燥得到固体样品用于后续结构表征。

结果与讨论

依来曲普坦的降解趋势

详细的降解条件与结果总结于表中。ELE在酸性和氧化条件下表现出降解敏感性。在酸性水解中，约17.08%的API降解为DP-4；在氧化降解中，DP-1、DP-2和DP-3的峰面积百分比分别为13.6%、10.16%和3.82%，剩余API为71.61%。

降解产物的结构确认

首先，通过HRMS、FT-IR和2D-NMR对ELE原料药的结构进行了确认。HRMS在正离子ESI模式下测得[M+H]⁺离子为383.1779 Da，分子式为C₂₂H₂₇O₂N₂S。NMR数据为降解产物的结构解析提供了参考。所有降解产物的结构均通过HRMS和2D-NMR（包括HSQC、HMBC）得到确认，关键NMR相关信号见图和表。提出的ELE在过氧化物和酸性条件下的降解机制见图。

降解产物DP-1的表征

DP-1和DP-2均来自氧化降解，其HRMS显示[M+H]⁺为415.1681 Da，分子式为C₂₂H₂₆N₂O₄S，比ELE分子量增加32 Da，提示可能发生了双氧化的过程。NMR研究，特别是与ELE的碳谱对比，揭示了关键变化：ELE中C17碳（108.62 ppm）在DP-1中位移至73.48 ppm，而C18碳由124.35 ppm（CH）位移至178.56 ppm（C=O）。HMBC实验中，H19亚甲基质子与C18碳的相关性，以及H15、H16质子与C17碳的相关性，证实吲哚环的C17和C18位被氧化，形成了2-氧代吲哚（2-oxindole）结构，并在C17位产生了一个新的手性中心。DP-1的结构被确定为2-((3-羟基-2-氧代-5-(2-(苯基磺酰基)乙基)吲哚-3-基)甲基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓。

降解产物DP-2的表征

DP-2的HRMS和分子式与DP-1完全相同。NMR数据也高度相似，化学位移仅有细微差别。详细的2D NMR分析（HSQC, HMBC）证实DP-2与DP-1具有相同的平面结构，即同样是C17位羟基化的2-氧代吲哚衍生物。两者在C17位新手性中心的立体构型不同，因此DP-1和DP-2被鉴定为一对非对映异构体。

降解产物DP-3的表征

DP-3的HRMS显示[M+H]⁺为381.1626 Da，分子式为C₂₂H₂₅N₂O₂S，比ELE少2 Da。¹H NMR中吲哚环CH质子信号消失，且脂肪区质子模式发生变化，特别是H20次甲基质子出现在5.23 ppm，H23亚甲基质子出现在3.85和3.96 ppm，H25甲基质子出现在3.59 ppm。¹³C NMR中，C20、C23和C25的化学位移分别变为90.83 ppm、66.40 ppm和53.26 ppm。HMBC关键相关性显示H25甲基质子与C18碳相关，这只有在吲哚环与吡咯烷环之间形成稠合的双环体系（吡咯里嗪环pyrrolizine）时才可能发生。因此，DP-3的结构被确认为4-甲基-8-(2-(苯基磺酰基)乙基)-2,3,4,5,10,10a-六氢-1H-吡咯里嗪并[3,2-b]吲哚-4-鎓，这是由分子内环化反应产生的。

降解产物DP-4的表征

DP-4来源于酸性降解，其HRMS显示[M+H]⁺为777.3486 Da，分子式为C₄₅H₅₃O₄N₄S₂，恰好是ELE分子量（减去HBr后）的两倍减去2 Da，表明它是一个二聚体。¹H NMR显示存在54个质子（包括盐质子），其中在4.25 ppm处出现一个新的亚甲基质子信号，这在ELE和其他DP中均未观察到。¹³C NMR谱图中碳信号数量约为总碳数的一半，支持了分子的对称性。HSQC确认新亚甲基碳（C55）的化学位移为23.27 ppm。关键的HMBC相关性显示，该新亚甲基质子（H55）与两个吲哚环上的C18和C45碳相关。这强有力地证实了DP-4是通过一个亚基桥（-CH₂-）连接两个ELE分子吲哚环的C2位（即ELE的C18位）而形成的二聚体。DP-4的结构被确定为双(3-((1-甲基吡咯烷-2-基)甲基)-5-(2-(苯基磺酰基)乙基)-1H-吲哚-2-基)甲烷。这是一种在ELE降解研究中首次报道的新型二聚体降解产物。

结论

本研究成功建立了用于分离和鉴定依来曲普坦氢溴酸盐降解产物的稳定性指示UHPLC–MS方法。药物在碱性、中性、热和光解条件下稳定，但在酸性和氧化条件下易降解，产生四种降解产物。通过综合运用UHPLC–MS、HRMS、FT-IR以及一维和二维NMR技术，首次完整地阐明了DP-1、DP-2（一对2-氧代吲哚非对映异构体）、DP-3（吡咯里嗪环化产物）和DP-4（新颖的C2-C'2二聚体）的结构。这些降解产物的形成机制涉及氧化、环化和二聚化等途径。该研究填补了ELE降解化学的知识空白，为其药品质量控制、稳定性评估和降解途径理解提供了重要的科学数据和支持。所建立的快速、高效的UHPLC–MS方法也适用于ELE及其制剂的常规分析。