通过添加植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和异常毕赤酵母（Pichia anomala）来提高甜高粱 bagasse 青贮饲料的质量：多组学分析的启示

《Biomass and Bioenergy》：Improving sweet sorghum bagasse silage quality by adding Lactobacillus plantarum and Pichia anomala: Insights from multi-omics analysis

甜高粱秸秆（SSB）作为糖汁提取的副产物，因高水分和可发酵糖易腐败而限制应用。本研究比较乳酸菌（LP）和毕赤酵母（PA）对SSB青贮发酵特性的影响，发现PA处理显著提高乳酸和可溶性碳水化合物含量，降低pH及酸溶纤维素含量，并促进乳酸肠球菌（L. sakei）定殖。多组学分析表明，L. sakei与维生素B族代谢相关，且PA通过调控微生物群落和代谢途径提升青贮稳定性。

　　

任海伟|杜永鹏|窦聚才|郭晓鹏|赵毅|李金平|王宇|卢东|郑毅

兰州理工大学生命科学与工程学院，中国甘肃省兰州市郎公坪路287号，730050

摘要

甜高粱渣（SSB）是榨汁过程中的丰富副产品，但其高水分和可发酵糖分使其容易迅速变质，从而限制了其作为反刍动物饲料或生物能源基质的大规模利用。作为一种杀菌酵母，Pichia anomala表现出良好的抗菌和防腐效果，被广泛用于谷物保存。本研究旨在探讨添加Lactobacillus plantarum（LP，一种常见的添加剂）和Pichia anomala（PA，一种创新的真菌添加剂）对SSB青贮过程中发酵特性、微生物群落和代谢特征的影响。在PA青贮料中，乳酸和水分溶性碳水化合物的含量显著高于CK和LP青贮料，而pH值、酸洗涤纤维和酸洗涤木质素的含量则显著低于CK和LP青贮料。此外，L. plantarum和Lactobacillus sakei分别是LP和PA青贮料中的优势菌种。多组学关联分析显示，优势菌种L. sakei与生物素和烟酰胺的含量高度相关，而这两者又与干物质含量高度相关。这种关联特征表明L. sakei驱动的代谢变化可能与干物质保存效果的改善有关。总之，这两种添加剂可以促进有益细菌生态系统的形成并调节相应的代谢模式，从而产生不同的发酵特性。特别是P. anomala在青贮过程中具有特定的调控作用，能够提高SSB青贮料的发酵质量。本研究提供了一种利用P. anomala添加剂改善SSB青贮质量的新方法。

引言

为了制造生化产品或生物能源，中国工业生物技术经常依赖于含糖或淀粉作物的生物转化[1]。然而，这种方法会干扰粮食供应。中国庞大的人口、不断减少的耕地以及城市化进程加剧了粮食需求。因此，寻找可替代的非粮食作物比以往任何时候都更为重要。甜高粱（Sorghum bicolor (L.) Moench）作为一种高产C4植物，生长速度快，是一种多用途的农业和能源作物，可用于生产食品、饲料、生化产品和生物能源。由于甜高粱茎秆中含有高量的可溶性糖分，易于被微生物快速发酵，因此从甜高粱中生产生物燃料和生物制品已成为全球趋势[2]。同时，榨汁后剩余的大量甜高粱渣（SSB）也给处理带来了挑战。作为农业废弃物，传统的填埋和焚烧处理方式不可避免地会导致环境污染和生物质资源浪费。因此，通过可持续和更清洁的方法有效处理SSB至关重要。作为一种典型的生物质，SSB由纤维素（35–50%）、半纤维素（20–30%）和木质素（15–25%）组成，经过化学预处理后可以通过酶解和发酵转化为高附加值的产品[2]。此外，由于SSB富含蛋白质、糖分、维生素和其他营养成分，它也被广泛用作反刍动物饲料[3]。然而，如果处理不当，SSB中的高可发酵糖分会促进不希望的发酵反应，导致酵母、真菌和其他病原微生物的生长[4]。如果保存得当，SSB的营养成分损失可以控制在10–15%以内[5]。因此，找到一种高效、经济且可持续的储存方法对于确保SSB的长期和大规模利用至关重要。

青贮是一种高效的生物质保存技术，不仅可以延长生物质的保质期，还是制造生物燃料的可行生物预处理方法[6]。青贮发酵的启动和持续依赖于新鲜原料中附生乳酸菌（LAB）的数量。LAB活性不足可能导致不希望的发酵过程，并通过积累丁酸和氨氮（AN）降低营养价值。常见的添加剂包括LAB、化学物质和酶，它们都能改善青贮质量。然而，酶添加剂成本较高且需要严格的条件，而化学添加剂则可能对反刍动物健康和环境造成影响[7]。在现有添加剂中，具有低成本和高效率优势的LAB能够将水分溶性碳水化合物（WSC）发酵为有机酸，减少干物质损失，增加乳酸比例，并在青贮过程中迅速降低pH值[8,9]。目前，如Lactobacillus plantarum、Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus buchneri等LAB菌株常用于青贮过程。尤其是L. plantarum在青贮生产中应用最为广泛[10]。除了细菌添加剂外，真菌添加剂也受到了关注。某些酵母可以通过抑制有害微生物的生长来作为有益的接种剂，确保生物质青贮的安全性和稳定性。例如，Saccharomyces cerevisiae、Humicola grisea和Candida glabrata已被用于稻草青贮的生产，它们能够迅速降低pH值并使粗蛋白（CP）浓度增加38–41%[7]。

作为一种杀菌酵母，Pichia anomala可以通过代谢葡萄糖产生乙酸，并对其同属菌株及其他特定菌株表现出杀菌毒性，从而显示出显著的抗菌和防腐效果[11]。因此，P. anomala被广泛用于小麦、黑麦、燕麦和大麦等谷物的储存。此外，P. anomala能够在青贮过程中耐受低pH值和厌氧条件。在大麦青贮中使用时，P. anomala可以降低霉菌数量并将肠杆菌降至检测不到的水平[12]。此外，喂食了含有P. anomala的大麦的鸡和肉牛没有出现健康问题或生长率下降的情况[12]。遗憾的是，目前尚未发现有关使用P. anomala》改善SSB青贮质量的报道。特别是与经典的L. plantarum添加剂相比，P. anomala在青贮过程中是否具有特定的调控作用或能否扩展SSB青贮的发酵特性仍不清楚。因此，假设P. anomala可以作为潜在的添加剂接种到SSB中，以提高青贮效率，为青贮过程创造更有利的环境，从而提高SSB的营养价值和储存稳定性。

此外，青贮过程涉及微生物群落的演替以及代谢物和代谢途径的变化[13]。为了确定青贮发酵的最终产物，代谢组学被认为是研究青贮过程中不同生化变化后代谢物变化的有效工具。Su等人[14]发现，在添加L. plantarum后的全株玉米青贮料中，增加的代谢物主要包括苯乙醛、L-异亮氨酸、氧脯氨酸、3-苯乳酸和肉桂醛。Du等人[13]发现，在纸桑青贮过程中，乳酸菌成为最优势的菌种，碳水化合物和氨基酸代谢是重要的微生物代谢途径。Xu等人[10]发现，经过L. plantarum处理的全株玉米青贮料含有更多的有机酸、氨基酸和酚酸等生物功能性代谢物。因此，多组学的综合应用将有助于深入了解青贮过程、微生物群落演替、微生物相互作用以及典型细菌和真菌添加剂驱动的代谢途径。本研究重点关注了由L. plantarum或P. anomala添加剂介导的SSB青贮系统，通过全面分析发酵质量、微生物组和代谢组等多种因素，探讨了这两种添加剂对SSB青贮质量的影响，以比较和理解它们潜在的增强机制。这项工作有望为SSB的有效青贮保存和利用提供宝贵的见解和指导。

材料

本研究中使用的甜高粱（KFJT1）种植于中国甘肃省白银市中国科学院现代物理研究所的试验田（纬度37.93°N，经度102.63°E）。收获后，使用 knife mill（LFS-SJ3FE17，中国佛山）直接对新鲜的全株甜高粱进行榨汁。榨汁后得到的SSB被切成2厘米的块状。L. plantarum（ACCC11016）购自农业微生物菌种保藏中心。

不同接种剂对青贮发酵特性的影响

表1详细总结了SSB青贮料的发酵特性和化学组成。值得注意的是，CK、LP和PA青贮料在14天青贮后的pH值均迅速降至4.2以下，这是一个表明青贮料保存良好的关键值[23]。pH值的快速下降是由于SSB青贮过程中乳酸（pKa = 3.86）和丙酸（pKa = 4.75）的积累所致。如表1所示，所有青贮料中的乳酸含量...

结论

综合研究表明，P. anomala在提高SSB青贮质量方面具有显著潜力。与L. plantarum相比，P. anomala可以增加WSC和乳酸的含量，并保持SSB的干物质（DM）。然而，在增加粗蛋白（CP）含量或降低丙酸和氨氮（PPA和AN）含量方面，P. anomala的效果不如L. plantarum。接种L. plantarum后，L. plantarum成为优势乳酸菌种，而P. anomala接种剂促进了L. sakei的生长。

作者贡献声明

任海伟：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、概念构思。杜永鹏：撰写 – 原稿撰写、验证、软件使用、方法学、实验设计。窦聚才：形式分析。郭晓鹏：撰写 – 原稿撰写、软件使用、方法学、数据管理。赵毅：方法学、形式分析。李金平：撰写 – 审稿与编辑。王宇：方法学。卢东：资源获取、方法学。郑毅：撰写 – 审稿与编辑、监督。

利益冲突

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了甘肃省重点研发计划 - 国际合作项目（项目编号25JRRA133）、国家重点研发计划（项目编号2022YFB4201901-1）、甘肃省自然科学基金（项目编号24JRRA203和25JRRA133）、甘肃省科技创新引导计划（项目编号24CXNA073）以及白银市科技项目（项目编号2024-1-27G）的财政支持。