《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：A Direct Comparison of STS-PCR and RFLP for Detection and Subtyping of Human
Blastocystis in Iran
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本研究首次在伊朗直接比较了STS-PCR和RFLP诊断Blastocystis的准确性，以nested PCR为内参标准。结果显示STS-PCR敏感性60.9%，RFLP达85.9%，但STS-PCR可识别RFLP漏检的9例。两者互补，需更多验证。
Ehsan Karimi|Zohreh Momeni|Vahid Nasiri|Azar Sabokbar
伊朗卡拉杰伊斯兰自由大学微生物学系微生物学博士候选人
摘要
Blastocystis是一种遗传多样性较高的单细胞真核肠道寄生虫，目前尚无金标准的诊断方法。本研究在伊朗进行，首次直接比较了序列标记位点（STS）PCR和限制性片段长度多态性（RFLP）在人类诊断中的效果。研究基于我们之前对同一样本群体的研究结果，旨在通过嵌套PCR作为内部参考来评估这两种方法的诊断敏感性和特异性。此外，我们还利用STS-PCR分析了该寄生虫的亚型和遗传多样性。共有124份粪便样本被纳入研究：其中64份通过嵌套PCR确认为阳性，60份为阴性。这些样本用于评估STS-PCR的诊断性能。RFLP也应用于嵌套PCR阴性的样本中，计算了灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）以及95%置信区间（CIs）。STS-PCR在64份嵌套PCR阳性样本中检测出39份（灵敏度60.9%，特异性100%，NPV 71%，PPV 100%）；但有25份样本未被检测到，这可能是由于引物不匹配或PCR抑制剂的影响。RFLP在64份阳性样本中检测出55份（灵敏度85.9%，特异性100%，NPV 87%，PPV 100%）。STS-PCR还识别出了RFLP未能检测到的9份样本。所有嵌套PCR阴性的样本在两种方法中均显示为阴性。对两例STS-PCR假阴性样本进行测序后，确认它们属于ST1和ST3亚型。STS-PCR与RFLP之间的检测差异凸显了在这种数据集中使用多重分子分析方法的必要性。需要进一步验证这些结果是否在其他人群或实验室环境中也成立。
引言
尽管全球卫生条件和医疗水平有所改善，但胃肠道寄生虫仍感染着大量人群[1]。这些感染的症状从无症状到严重并发症不等[2]。Blastocystis是最常见的肠道原生动物之一，全球约有10亿人受到感染，其感染率在工业化国家为0.5-24%，而在发展中国家则为30-60%[3]。准确检测Blastocystis对于明确其传播途径和评估其对人类健康的影响至关重要[4]。
Blastocystis的致病性仍存在争议[5]，其症状从轻微的胃肠道不适到严重并发症都有可能[6]。这种寄生虫具有极强的适应性，可感染哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖动物、爬行动物以及某些无脊椎动物[7]，主要通过粪-口途径传播[8]。
传统的检测方法（如直接显微镜观察和卢戈尔碘染色或三色染色）虽然能显示寄生虫的形态特征，但灵敏度较低[9]。目前分子诊断方法因其更高的特异性而被广泛使用[10]，但目前仍没有单一的金标准用于确诊Blastocystis[11]。
关于使用分子方法检测和分型Blastocystis的先前研究可分为三类：1. 基于PCR的传统方法，如嵌套PCR、STS-PCR和PCR条形码技术；2. 定量方法，如qPCR；3. 先进的高通量测序技术，如霰弹枪宏基因组学和Metabarcoding[12-18]。在我们之前在伊朗阿尔博兹省的研究中，我们对所有阳性样本同时使用了嵌套PCR和RFLP，发现存在显著的亚型多样性。这两种方法广泛用于亚型区分，在无法常规进行测序的情况下仍然适用[19]。
经过严格评估后，选择以18S rRNA小亚基基因（SSU）为目标的嵌套PCR作为内部参考方法。这一选择基于其高分析灵敏度、在不同人群中的广泛验证结果，以及其检测混合亚型感染的能力[12]。尽管存在一些局限性（如引物偏倚可能导致罕见或变异亚型的假阴性结果，粪便中的PCR抑制剂可能降低第一轮扩增效率，扩增后的样本处理会增加污染风险[20,21]），但仍决定使用嵌套PCR作为内部参考。
尽管伊朗已有研究探讨了Blastocystis的感染率和遗传多样性，但尚未直接比较嵌套PCR、RFLP和STS-PCR的诊断性能[22-24]。我们的主要目的是利用嵌套PCR作为内部参考，评估STS-PCR和RFLP的诊断准确性；次要目的是确定这些技术检测Blastocystis>的能力、区分其亚型以及探索其遗传多样性。据我们所知，这是伊朗首次在相同人类样本上直接比较STS-PCR、嵌套PCR和RFLP的研究。
伦理批准和知情同意
本研究使用了之前已获得批准的研究样本。所有程序均遵循《赫尔辛基宣言》（2013年）和伊斯兰自由大学卡拉杰分校研究伦理委员会制定的伦理指南（IR.IAU.K.REC.1400.066）。所有参与者在样本采集前均签署了知情同意书。
样本来源和选择
本次分析未收集新的粪便样本，而是使用了之前收集的124份样本进行了回顾性比较。
显微镜检查结果
在通过嵌套PCR检测为阳性的64份样本中，有21份（32.8%）也通过卢戈尔碘染色和三色染色方法确认为阳性。在这些样本中，观察到该寄生虫的 vacuolar 形态（图1）。
通过STS-PCR检测Blastocystis》亚型
在之前通过嵌套PCR确认为阳性的64份样本中，STS-PCR成功扩增了39份，占60.9%。其中33份属于ST1亚型（51.6%），6份属于ST3亚型（9.4%）。其余25份样本...
讨论
Blastocystis是一种遗传多样性极高的肠道原生动物，这使得其准确检测和分型变得复杂[27]。我们在伊朗阿尔博兹省采集的人类粪便样本上比较了STS-PCR、嵌套PCR和RFLP的检测效果。据我们所知，这是伊朗首次在相同的人类Blastocystis样本上应用这些分子技术进行比较。
与显微镜检查相比（显微镜检查在64份阳性样本中仅检测出21份阳性），...
结论
以嵌套PCR作为内部参考时，RFLP表现出更高的灵敏度和阴性预测值（NPV）。而STS-PCR则检测出了一些RFLP未能检测到的样本。这些结果表明这两种分子方法在该特定样本群体中具有互补作用，并不意味着其中一种方法绝对优于另一种。将该方法推广到其他人群或实验室环境仍需进一步验证。此处报告的所有诊断性能指标...
伦理声明
本研究遵循《赫尔辛基宣言》（2013年）的规定，并获得了伊斯兰自由大学卡拉杰分校研究伦理委员会的批准（IR.IAU.K.REC.1400.066）。所有参与者均签署了知情同意书。
财务支持
本研究未获得任何公共、商业或非营利机构的资助。
CRediT作者贡献声明
Ehsan Karimi：概念提出、初稿撰写、审稿与编辑、实验设计。Zohreh Momeni：概念提出、撰写、实验设计、数据分析。Vahid Nasiri：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验设计。Azar Sabokbar：实验设计、数据分析、结果可视化。
作者声明
我们声明本手稿为原创作品，未曾发表过，也未在其他地方提交。所有作者均已阅读并同意提交发表。
CRediT作者贡献声明
Ehsan Karimi：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、概念提出。Zohreh Momeni：初稿撰写、实验设计、数据分析、概念提出。Vahid Nasiri：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验设计。Azar Sabokbar：结果可视化、数据分析。
