《TRENDS IN FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY》：Research progress in microbial synthesis of D-allulose using metabolically engineered microbes
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D-Allulose作为低热量甜味剂在食品工业中潜力巨大，但其生产依赖可逆的DAEase酶促反应，存在平衡转化率低的问题。本文系统综述了微生物合成D-Allulose的四种主要途径：DAEase介导的直接合成、氢化/脱氢化耦合、醛缩合/脱磷酸化模块以及磷酸化/Epimerization/脱磷酸化多酶系统，并分析了不同碳源（如D-果糖、甘油、葡萄糖、木糖、蔗糖）的代谢调控策略，指出多酶协同与代谢工程是提高产率的关键。
Junchi Zhu|Like Fan|Jiajun Chen|Wei Xu|Azis Boing Sitanggang|Fina Amreta Laksmi|Junmei Ding|Wanmeng Mu
江南大学食品科学与资源国家重点实验室，中国江苏省无锡市，214122
摘要
背景
D-阿洛酮糖是一种功能性低热量糖，具有巨大的市场潜力。D-阿洛酮糖的工业生产主要依赖于D-阿洛酮糖3-差向酶（DAEase）对D-果糖的可逆酶促差向化反应。最近，通过基因工程改造了多种微生物，使其能够通过微生物发酵高效生产D-阿洛酮糖。
范围与方法
本文综述了四种典型的D-阿洛酮糖合成方法，包括基于DAEase的途径、基于差向化/氢化/脱氢的途径、基于醛醇反应/去磷酸化的途径以及基于磷酸化/差向化/去磷酸化的途径。
主要发现与结论
引入DAEase并删除D-果糖的代谢途径可以轻松实现从D-果糖制备D-阿洛酮糖，但这并不改变差向化反应的可逆性。引入特定的氢化酶和脱氢酶可以利用阿洛糖醇作为中间体来驱动D-阿洛酮糖的合成。设计了一种可编程的双向动态开关，能够高效地从D-果糖生产D-阿洛酮糖。可以将醛醇反应和去磷酸化模块引入微生物中，从而利用甘油生产D-阿洛酮糖；然而，这一过程中会生成大量的D-山梨糖作为副产品。还可以将磷酸化/差向化/去磷酸化途径引入微生物中，利用D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖或蔗糖生产D-阿洛酮糖。针对不同碳源，分别设计了相应的途径，并引入差向化-去磷酸化反应，以实现从D-果糖-6-磷酸高效生产D-阿洛酮糖。
引言
全球超重和肥胖问题呈持续蔓延趋势，尤其是在高收入国家，肥胖率问题尤为突出。肥胖严重威胁健康，已成为不容忽视的健康危机。肥胖与高能量饮食习惯密切相关；因此，控制能量摄入是预防肥胖的重要策略。15年前，美国实施了《平价医疗法案》（ACA），其中规定某些食品必须标注热量值，以提醒消费者注意能量摄入。同样，2025年中国启动了健康促进运动，重点关注由超重和肥胖引起的慢性疾病，并实施了为期三年的全国性体重管理专项行动。
甜味剂，尤其是糖类，是食品工业中最广泛使用的食品添加剂。目前全球糖市场年规模约为2亿吨。其中大部分为淀粉糖（主要是高果糖玉米糖浆）和蔗糖，这两者的热量含量都很高。近年来，功能性低热量甜味剂作为传统甜味剂的替代品受到了广泛关注。D-阿洛酮糖是一种新型的功能性低热量甜味剂（Tao等人，2025年）。D-阿洛酮糖，以前也称为D-吡酮糖，是D-果糖的C-3位差向体，其甜度约为蔗糖的70%，但热量仅为其不到10%。它天然存在于某些植物中，但在加工后的甘蔗和甜菜糖蜜中的含量极低。许多国家和地区已批准使用D-阿洛酮糖，它在食品工业中得到广泛应用。自2012年起，美国将其列为GRAS安全物质，并自2019年起免于“添加糖”标签要求。日本、加拿大、新加坡、韩国、墨西哥、澳大利亚和新西兰也批准其作为新型食品使用。值得注意的是，四个月前中国也批准了其使用，这表明D-阿洛酮糖在中国具有巨大的商业潜力。对于另一个拥有庞大市场的地区——欧盟，虽然几年前就已启动相关法规，但欧洲食品安全局（ESFA）最近表示，由于申请人未提供额外数据，其作为新型食品的安全性尚未得到确认。
作为新一代功能性甜味剂，D-阿洛酮糖因其独特优势而受到业界广泛关注。除了低热量特性外，它对人体健康还有许多有益作用（Daniel等人，2022年）。D-阿洛酮糖能显著降低餐后血糖水平及血糖波动时间，显示出其在2型糖尿病患者血糖控制中的潜在作用（Ayesh等人，2024年）。它通过调节脂肪生成相关转录因子，抑制前脂肪细胞的分化和脂质积累，显示出在减肥功能性产品开发中的应用潜力（Moon等人，2020年；Yamazaki等人，2023年）。它通过增强B型 scavenger 受体在肝脏中的表达，提高HDL-胆固醇的摄取，从而降低HDL-胆固醇水平并预防动脉粥样硬化（Kanasaki等人，2020年）。它还具有神经保护作用，通过调节细胞内谷胱甘肽浓度，在中枢神经系统退行性疾病的治疗中发挥作用（Takata等人，2005年）。它对缺血性中风和肥胖-胰岛素抵抗患者的大脑有积极作用，有望成为代谢性脑血管疾病的突破性干预策略（Zheng等人，2025年）。此外，它还具有抗氧化和抗炎作用，显示出在制药和营养保健品行业的应用潜力（Zhang等人，2023a）。
D-阿洛酮糖可与食品蛋白质发生美拉德反应，产生吸引人的颜色和香气。此外，它还能有效降低冷冻食品（如冰淇淋）的冰点。这些特性使D-阿洛酮糖成为高热量食品（如食品和饮料、烘焙产品、冷冻甜点、调味品）的理想选择（Wen等人，2025b；Sipple等人，2022；Xue等人，2025）。大量研究结果表明，D-阿洛酮糖在食品应用中具有独特优势。它可以提高酵母烘焙产品的新鲜度，减少因面包屑过于干燥而导致的食品浪费（Wittland等人，2025年）。添加D-阿洛酮糖可增强小麦淀粉系统的结构密度，提高小麦淀粉的糊化程度，并延缓其回生（Wang等人，2024年）。它还能与食品蛋白质（如干蛋清和卵清蛋白）发生美拉德反应，改善其凝胶化行为，产生良好风味，并在长期储存过程中保持高抗氧化活性（Mu等人，2012年）。此外，它还能提高蛋清蛋白的起泡性能和黄油饼的质量（Sun等人，2008年）。
由于D-阿洛酮糖的低热量和独特的健康特性，以及其在食品质地和风味上的改进作用，加上其在全球范围内的逐步批准，预计其在食品工业中的需求将呈爆发性增长。目前，D-阿洛酮糖的工业生产主要依靠酮糖3-差向酶（KEase）对D-果糖的酶促差向化反应。KEase主要催化各种酮糖之间的可逆C-3位差向化反应，其中D-果糖/D-阿洛酮糖差向化反应的酶活性最高，这种酶被称为D-阿洛酮糖3-差向酶（DAEase）。近年来，关于KEase的研究非常深入和系统化。自1993年首次报道从Pseudomonas chivici ST-24中鉴定出KEase以来（Izumori等人，1993年），目前已从多种微生物中鉴定出30多种KEase。其晶体结构和催化机制已被确定。通过理性、半理性或非理性设计对KEase进行分子修饰，以提高其催化效率和酶学特性，并通过转录和翻译调控的多维度策略增强其异源表达（Tao等人，2025年）。其最高比活性（针对D-果糖）已超过1,000 U/mg（Liu等人，2022年），熔点提高到80 °C（Chen等人，2022年），在Bacillus subtilis宿主中的表达活性提高到近5,000 U/mL（Liu等人，2022年）。这些显著参数指标大大降低了D-阿洛酮糖工业生产的生物技术成本。
然而，D-阿洛酮糖酶促合成中最主要的问题是KEase差向化的可逆性，D-阿洛酮糖和D-果糖的平衡比例约为30:70。这需要引入模拟移动床（SMB）工艺进行有效分离，但该工艺存在工艺复杂、分离能耗高、污染严重和成本增加等问题。通过添加硼酸，可以改变平衡比例，有利于D-阿洛酮糖的生成（Wen等人，2025a）。但去除硼酸仍然复杂且会导致环境污染。最近，几种基于热力学的多酶策略被开发出来用于生产D-阿洛酮糖，理论上可实现100%的转化率（Li等人，2021年），但这通常需要表达和纯化多种酶。一种解决方案是将这些酶引入宿主细胞中构建合成途径，增强代谢流，结合微生物发酵以高转化率和产量合成D-阿洛酮糖。
此前，基于KEase的D-阿洛酮糖生产方法已得到广泛研究（Chen等人，2024年；Ivanova等人，2023年；Tan等人，2023年；Xie等人，2025年）。作为D-阿洛酮糖工业生物合成中的一个重要趋势，微生物合成研究正在逐渐增加。本文主要对D-阿洛酮糖的微生物合成方法进行了系统综述。
部分摘要
基于DAEase的微生物培养中D-阿洛酮糖的生物合成
已广泛研究了纯化酶（图1A）或整个细胞催化的D-阿洛酮糖生产。本文重点介绍了基于体内 DAEase的D-阿洛酮糖微生物合成（图1B）。Guo等人利用透化的SecY蛋白转运通道改造了大肠杆菌中的糖转运途径，为特定己糖生产的细胞工厂提供了独特的糖传递途径（Guo等人，2020年）。这种工程化的通道被引入重组大肠杆菌基于差向化/氢化/脱氢的微生物D-阿洛酮糖生物合成
DAEase通过热力学平衡从D-果糖生成D-阿洛酮糖。通过以阿洛糖醇为中间体的进一步酶促REDOX系统，可以打破热力学限制，完全将酶促生产转向D-阿洛酮糖（图2）。D-果糖/D-阿洛酮糖差向化后，D-阿洛酮糖被核糖醇2-脱氢酶（RDHase）不可逆地氢化为阿洛糖醇，同时辅因子NADH氧化为NAD+，随后阿洛糖醇进一步不可逆地脱氢回基于醛醇反应/去磷酸化的微生物D-阿洛酮糖生物合成
依赖二羟基丙酮磷酸（DHAP）的醛醇酶催化DHAP与多种醛的醛醇加成反应，在多种单糖及其衍生物的生产中受到广泛关注（Dai等人，2021年）。L-鼠李糖-1-磷酸醛醇（RhaD）可特异性地从外消旋甘油醛选择L-甘油醛，仅生成L-果糖-1-磷酸（Franke等人，2003年）。2011年，Li等人首次尝试使用D-甘油醛作为受体，发现大肠杆菌基于磷酸化/差向化/去磷酸化的微生物D-阿洛酮糖生物合成
最近，建立了一种基于磷酸化-去磷酸化的体外多酶级联反应策略，用于从廉价淀粉合成多种重要单糖，该策略具有热力学驱动特性，因此产量非常高。该策略包括三个模块，涉及五种酶：无ATP磷酸化、糖磷酸异构化/差向化和去磷酸化（Zhang等人，2023b）。结论与未来展望
D-阿洛酮糖是一种功能性超低热量糖，被视为食品工业中新一代有前景的甜味剂。D-阿洛酮糖的工业生产主要依赖于使用DAEase对D-果糖的可逆酶促差向化反应。通过分子修饰、高水平表达和高效固定DAEase，已成功显著降低了D-阿洛酮糖工业化的生物技术成本；然而，DAEase的可逆性仍是一个挑战
CRediT作者声明
Junchi Zhu、Like Fan和Jiajun Chen：概念构思、初稿撰写；Wei Xu、Azis Boing Sitanggang和Fina Amreta Laksmi：研究、撰写、审稿和编辑；Junmei Ding和Wanmeng Mu：资金获取、监督、审稿和编辑
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（编号：2022YFD2101400）和江南大学食品科学与资源国家重点实验室开放项目计划（编号：SKLF-KF-202508）的财政支持。
