《Plant Biotechnology Journal》：A Novel Dual-Target Compound Designed With Potent Herbicidal and Fungicidal Activity Inspired by Conserved Phytoene Synthase Domains
1 引言
随着全球人口预计在2050年达到98亿，对粮食供应的需求将持续增长。农药在控制杂草和病原体以实现有效作物保护和农业生产方面发挥着至关重要的作用。然而，农药的不当使用也导致了诸如农药抗性等问题。为了应对这些挑战，发现新靶点和设计具有新作用模式的绿色化学结构日益受到关注。随着比较基因组学的快速发展，我们期望利用这一工具寻找跨物种（如植物和病原真菌）的进化保守靶点，以设计兼具除草和杀菌特性的双靶点化合物——更精确地说，这是一种通过靶点组结构相似性分析设计广谱农用化学品的策略。
发现此类新型双靶点化合物的一个 promising 途径是植物中必需的类胡萝卜素生物合成途径。类胡萝卜素是一类广泛存在于光合生物（包括植物、藻类和蓝细菌）中的类异戊二烯代谢物。在植物中，类胡萝卜素及其衍生物对光合作用和光保护至关重要。阻断类胡萝卜素生物合成会诱导叶绿素的氧化分解，在植物中表现出白化表型，最终导致植物死亡。由于类胡萝卜素合成途径是植物所独有的，该途径中的关键限速酶有潜力被开发为绿色农药靶点。作为一个关键的限速酶，八氢番茄红素合酶（PSY）催化类胡萝卜素生物合成途径的第一步，随后是八氢番茄红素脱饱和酶（PDS）和ζ-胡萝卜素脱饱和酶（ZDS）。迄今为止，已有七种靶向PDS的商业漂白除草剂（如氟啶酮和氟吡呋喃）被广泛使用。此外，位于PDS下游的ZDS也显示出设计漂白除草剂的潜力。在整个类胡萝卜素生物合成途径中，我们注意到PSY通过多种调控在控制类胡萝卜素总量方面起着限速作用。PSY活性的失调将严重影响类胡萝卜素积累和植物生长。
由于PSY参与类胡萝卜素生物合成途径的第一步，PSY同源物的结构在其他物种中可能也是进化保守的。通过对不同物种中PSY同源物的多序列比对，我们发现PSY不仅在植物中高度保守，而且与真菌和细菌中的角鲨烯合酶共享一个保守的异戊二烯基转移酶结构域。在真菌中，角鲨烯合酶（erg9）与PSY表现出极大的结构和催化底物相似性，而在细菌中，则是脱氢角鲨烯合酶（CrtM）。值得注意的是，erg9是真菌中麦角固醇合成的关键限速酶，麦角固醇对于决定膜流动性、通透性和膜相关蛋白活性的真菌细胞膜至关重要。如果麦角固醇生物合成途径被阻断，也将限制病原真菌的生长。这些证据暗示，有可能从PSY的晶体结构开发出一种兼具除草和杀菌活性的双靶点药剂。据我们所知，尚未有报道靶向PSY结构域且具有除草和杀菌特性的药剂。
作为基于PSY同源物开发双靶点抑制剂的的概念验证，我们首先通过多序列比对确认了PSY和erg9在不同物种间的结构相似性。随后分别使用病毒诱导的基因沉默（VIGS）和CRISPR-Cas9基因敲除进一步研究了PSY在植物中和erg9在真菌中的生理功能。然后利用PSY结构进行虚拟筛选和结构优化，获得了具有除草和杀菌活性的先导化合物1c。通过体外和植物体内分析全面研究了1c的作用模式（MOA）。所有这些结果表明，1c是一种兼具除草和杀菌活性的双靶点化合物。
2 结果
2.1 PSY和erg9中的保守催化位点使得双靶点抑制剂设计成为可能
为了评估PSY作为新型除草剂靶点的潜力，我们基于氨基酸序列对NCBI数据库中所有可用的植物PSY同源物进行了多序列比对。151种种子植物中PSY的序列相似性超过50%，且大多数植物的相似性甚至超过70%，表明其具有高度的进化保守性。为了研究开发双靶点抑制剂的潜力，我们扩展了分析以识别非植物物种中的PSY同源物。该分析发现了PSY与两种蛋白质之间的显著相似性：真菌中的角鲨烯合酶（erg9）和细菌中的脱氢角鲨烯合酶（CrtM）。重要的是，erg9是麦角固醇生物合成（真菌膜的基本组成部分）中的限速酶，而CrtM对于细菌中毒力因子葡萄球菌黄素的合成至关重要，这使得它们分别成为经过验证的杀菌剂和抗菌剂靶点。
我们接下来比较了PSY、erg9和CrtM的功能和结构相似性。它们的催化反应具有高度相似性。此外，尽管整体序列相似性仅为27.29%，但它们的三级结构高度相似，PSY/erg9和PSY/CrtM之间的RMSD值较低。系统发育分析显示，PSY和erg9属于系统发育树中的同一亚支，分支位置相邻，表明它们之间存在密切的进化关系。我们在PSY活性位点内识别出三个保守基序，这些基序也存在于erg9和CrtM中。关键的是，关键的催化残基分布在这些基序内。这些发现为开发作用于PSY和erg9的双靶点抑制剂提供了坚实的结构基础。
2.2 PSY和erg9作为双靶点抑制剂必需靶点的遗传学验证
为了验证进化相关的酶PSY（在植物中）和erg9（在真菌中）作为双靶点抑制剂靶点的潜力，我们采用了并行的遗传学策略。在拟南芥中，同时使用病毒诱导的基因沉默（VIGS）和CRISPR-Cas9介导的敲除来验证PSY的关键作用。在靶基因沉默效率超过90%的前提下，仅在沉默PSY、PDS和ZDS后，拟南芥叶片中的叶绿素含量显著下降（与对照组相比约下降80%）。PSY沉默组拟南芥幼苗的地上部分鲜重下降了约85%，略优于PDS沉默组（70%），与ZDS沉默组相当。在分别沉默PSY、PDS和ZDS的处理组中，叶绿素含量、花茎高度、莲座丛分枝数和主干分枝数无显著差异。随后，使用CRISPR-Cas9介导的敲除，我们获得了几种PSY和PDS突变体，并通过白化叶片的存在和Sanger测序进行了确认。与野生型幼苗相比，PSY和PDS敲除突变体均表现出严重的生长受损，这归因于缺乏有效的光合作用。
类似地，在酵母中，CRISPR-Cas9介导的erg9敲除是致死的，这通过几乎完全没有存活菌落来证明，而引入同义突变或插入终止密码子的对照实验证实致死性特异性地是由于蛋白质功能丧失所致。这一直接的遗传学证据确定，PSY和erg9对于各自生物的生存都是必需的，最终验证了它们是开发具有除草和杀菌活性的单一药剂的高价值靶点。
2.3 具有除草和杀菌活性的先导化合物1a的鉴定与验证
在遗传学上验证了PSY和erg9作为必需靶点后，我们试图鉴定一个候选的双靶点先导化合物用于结构优化。我们基于分子对接对拟南芥PSY（AtPSY）结构进行了包含21万个化合物的库的高通量虚拟筛选。基于分子量、脂水分配系数、结合亲和力和结构特征的连续过滤将候选物缩小到43个化合物。对稗草和油菜的生物活性测定鉴定出两个活性命中化合物（化合物14和33），它们含有1,2,4-三唑环部分。化合物14和33在100 μg/mL浓度下对油菜种子的抑制活性超过80%，而在相同剂量下对稗草的抑制活性分别为35.5%和73.4%。药效团分析和基于结构的设计导致选择了先导化合物1a。
我们随后通过表面等离子共振（SPR）亲和力（KD为132.7 μM）和有利的对接结合能（-8.9 kcal/mol）确认了1a与AtPSY的结合。接下来，我们评估了化合物1a的生物活性。在此，使用最广泛使用的类胡萝卜素生物合成途径靶向除草剂（靶向PDS）氟吡呋喃作为除草活性评估和白化表型分析的阳性对照。关键的是，1a表现出与PSY抑制一致的生物活性，在拟南芥中引起与除草剂氟吡呋喃相当的白化表型，并对禾谷镰刀菌的生长抑制约50%。分子对接显示，1a通过关键相互作用结合在AtPSY内的一个疏水空腔中：其间位三氟甲基苯基部分与Phe146等残基发生疏水和π-π堆积相互作用，而其苄硫基部分与由Ala255和Val258形成的疏水区域结合。三唑环氨基与位于弱极性环境中的Ser370之间形成的关键氢键进一步稳定了结合。保守性分析显示这些相互作用的残基在物种间高度保守，支持了1a作为进一步优化的广谱、双效模板的潜力。
2.4 构效关系（SAR）与1a衍生物的合成
根据先导化合物1a与AtPSY的分子对接结果，我们进行了构效关系研究，以改善其类药性、生物活性和亲水性。我们基于以下优化策略设计并合成了三个系列的28个类似物：（1）卤素取代：为了研究卤素类型和位置的影响，我们在三唑环5位支链苯环的不同位点引入了氯、溴或碘原子，得到化合物1a-5a和9a-15a。（2）电子和空间效应：为了探究电子和空间影响，我们在同一支链苯环上引入了吸电子基团（NO2, CF3）和供电子基团（CH3）。（3）侧链延长：为了评估增加极性和构象灵活性的效果，我们在三唑环与其5位支链苯环之间插入了一个羰基，创建了类似物1b-4b。（4）4位苯环的修饰：为了进行比较，我们在位于三唑环4位的苯环上的不同位置引入了氯原子，生成化合物1c-9c。所有合成的化合物均通过1H NMR、13C NMR、19F NMR和高分辨率质谱（HRMS）进行了充分表征。
2.5 生物学评价揭示1c为强效双靶点抑制剂
生物学筛选鉴定出几种具有显著活性的化合物。针对六种杂草的除草活性测定显示，虽然许多化合物无活性，但类似物2b、3b，尤其是6c在750 g a.i./ha的剂量下表现出强效作用。化合物6c表现出卓越的广谱除草活性，抑制所有六种测试杂草（抑制率80%–100%），优于阳性对照氟吡呋喃。同时，杀菌活性筛选显示，其他类似物，如1c，对多种病原真菌（梨生壳多孢菌、灰葡萄孢菌、茄链格孢菌、核盘菌和落花生尾孢菌）表现出强效、广谱的抑制活性（>60%），与百菌清相当。值得注意的是，几种具有除草活性的化合物（5a, 11a, 2b, 3b, 6c）也显示出杀菌活性，例如6c和11a对灰葡萄孢菌的抑制率为60%。
尽管1c在最初的温室试验中活性较弱，但使用茄链格孢菌对其进行了进一步研究。它表现出剂量依赖性的真菌生长抑制，并引起菌丝干燥和破裂，这与麦角固醇生物合成抑制一致。当在拟南芥上重新评估时，1c诱导了特征性的白化漂白表型，并导致显著的幼苗死亡率，证实它也具有强效的除草活性。1c的鉴定证实了双靶向保守的PSY/erg9的可行性。
2.6 化合物1c结合PSY破坏类胡萝卜素生物合成并诱导致死性氧化应激
1c的活性被证实源于其对PSY和erg9的直接抑制。体外结合测定证明1c以高亲和力结合PSY（KD= 45.0 ± 24.1 μM）。类似地，1c对erg9也具有高靶点结合能力（KD= 46.5 ± 9.8 μM）。相比之下，MBP标签未显示与1c的结合亲和力，排除了MBP标签可能的干扰效应。同时，差示扫描荧光法（DSF）和热位移测定（TSA）表明这种结合改变了蛋白质的构象并降低了其稳定性。这种抑制随后通过1c处理的植物中PSY底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的显著积累得到功能验证——这种效应在PDS抑制剂氟吡呋喃处理中未观察到。1c对类胡萝卜素途径的阻断引发了活性氧（ROS）的爆发和随之而来的超氧阴离子清除能力的下降。这种氧化应激伴随着抗氧化酶（如过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT）活性的短暂增加，最终导致叶绿素分解、特征性的白化表型和植物死亡。
为了深入了解1c的作用模式，我们进行了转录组和代谢组分析。转录组分析显示，1c处理显著改变了拟南芥幼苗中5260个基因的表达，包括2603个上调和2657个下调的差异表达基因（DEGs）。随后使用不同数据库（GO和KEGG）对DEGs进行注释，以分类CK组和1c处理组之间DEGs的功能。通路富集分析表明，1c处理后的DEGs在芥子油苷生物合成和核糖体通路中显著富集，这些通路对植物生长至关重要。正如预期，类胡萝卜素生物合成通路是最显著富集的，与光合作用膜和天线蛋白相关的基因被强烈下调，证实了光合作用受到严重抑制。12个DEGs（涉及三个代谢通路）的表达水平也通过RT-qPCR进行了验证。此外，值得注意的是，参与核糖体以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路的基因均被1c显著改变。GO富集分析进一步表明，DEGs最丰富的条目富集在细胞组分中，如叶绿体类囊体、光合作用膜、叶绿体类囊体膜和叶绿体类囊体腔。
代谢组分析进一步证实了类胡萝卜素途径的崩溃，显示了对光合作用至关重要的下游代谢物（包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和叶黄素）的急剧减少。总的来说，这些多组学数据描绘了一个全面的机制：1c抑制PSY，破坏类胡萝卜素和叶绿素代谢，抑制光合作用，并诱导致命的氧化损伤。
2.7 分子动力学模拟阐明1c的双靶点结合机制
为了理解其双重除草和杀菌活性的结构基础，我们进行了分子动力学（MD）模拟，以分析活性化合物1c和6c与其靶标PSY和erg9的结合。在50 ns的模拟过程中，两种化合物都稳定地结合在各自蛋白质的活性位点内。结合自由能的计算显示，当与PSY结合时，1c和6c显示出相似结合能；而当与erg9结合时，1c显示出比6c更低的结合能。MM/GBSA能量显示，1c与erg9的范德华力（ΔEVDW）和静电能量（ΔEele）高于6c的相应值，这表明1c与erg9的结合亲和力优于6c。1c与erg9的这种更优越的结合，主要由更有利的范德华力和静电相互作用驱动，为其相较于6c增强的杀菌效力提供了分子层面的解释。
对平均模拟构象的分析表明，两种化合物在同一蛋白质内共享高度相似的结合模式。在PSY中，Phe146的侧链与1c和6c的苯环形成π-π相互作用，Ser262、Ser370以及Tyr374和Asn290的残基与1c和6c形成静电相互作用，而Leu359、Val367和Leu286等残基分别与1c和6c形成疏水相互作用。在erg9中，Phe63、Tyr82、Leu240和Ala205等一堆残基与1c和6c形成疏水相互作用。与erg9相比，两种化合物在PSY的口袋内结合得更深。这种现象可能是由于erg9的Phe63和Phe345的空间效应所致，而PSY在相应位点含有Thr145和Leu359残基，不具有这种效应。
使用MM-GBSA方法进一步分析了化合物1c/6c与PSY/erg9之间结合自由能的分解。在PSY中，对化合物稳定结合贡献最大的氨基酸残基是Ala255、Val258、Ala283和Val367。相比之下，在erg9中，Phe63、Val208、Leu212和Leu240表现出比其他氨基酸残基更低的结合自由能（ΔGbind超过-1.5 kcal/mol）。这表明由这些氨基酸残基形成的疏水环境可能在维持三唑环和整个化合物的构象稳定性方面起着至关重要的作用。这些发现描绘了使1c能够作为强效双靶点抑制剂的精确相互作用。
3 讨论
开发具有新颖作用模式的新型高效、生态友好型除草剂仍然是对抗日益增长的农药抗性所必需的，这给作物生产带来了巨大挑战。为了解决这个问题，我们提出并验证了一种新策略：利用跨物种的进化保守蛋白质结构域来设计双靶点抑制剂。类胡萝卜素生物合成途径因其在植物中的重要作用、在动物中的缺失（确保选择性）以及抑制后产生的易于观察的白化表型而成为理想的概念验证。在该途径中，PSY被确定为首要候选靶点。它是一种高度保守的限速酶，尚无报道的商业抑制剂，并且我们在拟南芥中使用VIGS和CRISPR-Cas9进行的遗传学验证证实了其对于植物生存的必要性。关键的是，整合比较基因组学（MSA）的生物信息学分析揭示了植物PSY和真菌角鲨烯合酶（erg9）之间的显著结构相似性，erg9是麦角固醇生物合成中的关键酶。在真菌中敲除erg9后观察到的致死表型促使我们假设：单一化合物可以抑制这两种酶，从而产生双重除草和杀菌活性。
在靶点鉴定之后，针对拟南芥PSY结构的高通量虚拟筛选，随后进行生物活性测定，鉴定出一个含有1,2,4-三唑的先导化合物1a。对该骨架的初步优化产生了两个关键化合物：6c，一种强效的广谱除草剂；和1c，它表现出期望的双重除草和杀菌活性。1c与PSY和erg9的结合在体外以低微摩尔亲和力得到证实，其功能性抑制通过植物中PSY底物（GGPP）的积累和真菌中类似麦角固醇缺乏的菌丝损伤得到证明。构效关系（SAR）研究表明，引入3,4-二氯苯基对于双重活性至关重要。基于化合物与靶蛋白之间的相互作用，结合口袋中仍有更多的分子空间来根据来自不同物种的靶蛋白微调生物活性。这些证据也表明，1c可以作为在除草和杀菌活性平衡方面进行进一步优化的双效先导结构。
通过多方面的系统方法阐明了1c的作用模式。在植物中，PSY抑制引发了一个明确的级联反应：类胡萝卜素生物合成的破坏导致活性氧（ROS）爆发、氧化性叶绿素降解（白化）和植物死亡，这通过转录组和代谢组分析得到证实。在真菌中，erg9的抑制通过阻断麦角固醇生物合成损害膜完整性，导致菌丝破裂和细胞死亡。分子动力学模拟为1c的双靶点能力提供了结构上的理由，显示其在PSY和erg9的活性位点内都能稳定结合，尽管由于它们结合口袋的差异而具有不同的相互作用谱。根据我们的实验证据，我们提出了化合物1c作为潜在除草剂和杀菌剂的两种致死机制。对于除草活性，1c通过选择性抑制PSY阻碍植物中的类胡萝卜素生物合成，导致植物叶片中ROS积累，并促进植物出现白化死亡。对于杀菌活性，1c通过选择性抑制erg9阻断真菌中的固醇生物合成，破坏真菌膜完整性，导致真菌菌丝破裂并最终死亡。
虽然化合物1c是一个有前景的双靶点先导化合物，但其更广泛的应用需要进一步研究。一个关键的考虑因素是选择性：尽管靶向结构域在物种间是保守的，但必须系统地评估1c对作物、有益微生物或其他生物的潜在脱靶效应。此外，由于缺乏针对PSY和erg9的稳健酶学测定方法，对1c作用机制的直接验证仍然部分受限，阻碍了对酶抑制的定量评估。因此，未来的工作将侧重于使用先进的计算工具——例如AlphaFold3、ESM-2、RFdiffusion2和GeoDirDock——来预测和优化化合物在更广泛物种中的效力和选择性。这将指导合理设计新的类似物，以增强对目标害虫的效力，同时最大限度地提高选择性以避免非目标物种。
据我们所知，这是首次报道具有可证明的双重除草和杀菌活性的PSY靶向化合物。这种靶向进化保守结构域的策略为开发可调控、有效且能克服抗性的农药开辟了新途径。我们预计，这种基于靶点组结构相似性的广谱农药设计也将适用于其他关键蛋白质，这将指导设计具有可调控选择性的广谱农药，以应对抗性、效力和安全性方面即将到来的挑战。
