《Advanced Science》：Rupestonic Acid of Artemisia Rupestris L. Extract Treats Pulmonary Fibrosis in COPD by Targeting TGF-β1
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本研究揭示了岩蒿乙醇提取物（EEAR）及其活性成分岩蒿酸（RA）通过直接结合并抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）的泛素化和构象变化，进而阻断TGF-β1/Smad2/3信号通路，显著改善香烟烟雾（CS）诱导的慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型中的肺纤维化（PF）、上皮间质转化（EMT）和胶原沉积，为COPD相关PF的治疗提供了新型候选药物。
背景
肺纤维化（PF）是慢性进行性间质性肺病，以肺实质被纤维瘢痕组织替代为特征，导致肺功能下降，通常是慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺损伤的最终阶段。PF损害肺功能，导致气体交换进行性下降，最终可能导致死亡。目前FDA批准的两种药物尼达尼布和吡非尼酮仅能减缓疾病进展，无法治愈疾病，且存在严重副作用。因此，开发PF新药迫在眉睫。转化生长因子-β1（TGF-β1）是研究最深入的促纤维化细胞因子之一，在PF发病机制中起核心调控作用。Smad2和Smad3是促进TGF-β1介导PF的主要下游调节因子。激活的TGF-β1-Smad2/3信号通路诱导成纤维细胞增殖和活化，促进上皮间质转化（EMT）过程，刺激促炎和促纤维化细胞因子表达，从而加速PF进程。因此，靶向TGF-β1可能是保护PF过程中正常肺结构的有效策略。传统中药一直是药物发现的重要来源。岩蒿（Artemisia rupestris L.）是蒿属多年生草本植物，广泛分布于中国新疆，作为中药具有抗炎、抗病毒和肾脏保护作用。近期研究表明，岩蒿通过抑制MAPK/NF-κB信号通路和NO等炎症因子表达来抑制肺部炎症。然而，岩蒿是否具有抗纤维化特性尚未被研究。
EEAR减轻CS诱导的小鼠肺部炎症、肺实变和气道阻塞
研究首先评估了EEAR对CS暴露诱导的肺损伤的保护作用。CS暴露组小鼠体重显著减轻，EEAR预处理组小鼠体重迅速恢复，而长期地塞米松（DEX）治疗导致体重显著减轻，显示DEX的不良反应。H&E染色显示EEAR改善了CS诱导的炎症细胞浸润、气道闭合和气道重塑。EEAR抑制了肺中IL-1β、IL-6和TNF-α的产生。此外，EEAR显著降低了CS诱导的肺分泌粘液蛋白MUC5AC的增加，表明EEAR可缓解CS诱导的气道阻塞。微CT结果显示EEAR降低了肺密度，防止了CS诱导的肺实变。动脉血气分析显示EEAR显著改善了CS暴露导致的PaO2水平下降和PaCO2水平升高，缓解了肺损伤所致肺气体交换功能障碍。这些发现表明EEAR显著抑制PF、肺部炎症和气道阻塞，从而减轻COPD中的肺损伤并改善血氧水平。
EEAR通过抑制气道纤维化和纤维失衡缓解PF并影响TGF-β1表达
Masson染色显示CS诱导肺气道周围蓝色染色的胶原纤维增加，EEAR缓解了这种增加。免疫荧光（IF）标记α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，肌成纤维细胞标志物）和胶原蛋白I（胶原纤维标志物）显示，EEAR抑制了CS诱导的气道上皮细胞中α-SMA的上调和肺中胶原蛋白I的上调，以及纤连蛋白mRNA，从而缓解EMT和胶原沉积。EVG染色显示CS暴露导致气道周围弹性纤维缩短和增厚，EEAR改善了此现象。同时，EEAR抑制了CS诱导的肺气道和肺组织中MMP-2分泌增加。EEAR显著抑制了TGF-β1 mRNA表达的上调，表明TGF-β1是EEAR抗纤维化作用的潜在治疗靶点。因此，EEAR通过抑制MMP-2表达、缓解EMT、胶原沉积和弹性纤维分布不均来改善PF。
EEAR通过TGF-β1-Smad2/3通路预防EMT和胶原沉积
为探讨EEAR作用机制，研究使用香烟烟雾提取物（CSE）处理的人支气管上皮细胞（Beas-2B）建立体外模型。EEAR在1.25、2.5和5 mg/mL浓度下提高了CSE诱导的Beas-2B细胞活力。EEAR显著抑制了CSE诱导的TGF-β1蛋白和mRNA表达增加。CSE刺激后p-Smad2/3和Smad2/3显著增加，但EEAR处理组蛋白水平降低。同时，EEAR阻止了CSE诱导的Beas-2B细胞中α-SMA和纤连蛋白的增加。CSE诱导的Beas-2B细胞中胶原蛋白I的荧光强度与EEAR剂量负相关。在Beas-2B细胞中，EEAR抑制了CSE诱导的MMPs（MMP-2和MMP-12）及其活性调节蛋白（PAI-1和TIMP-1）的分泌。伤口愈合实验显示EEAR阻止了CSE诱导的Beas-2B细胞迁移。这些结果表明EEAR通过抑制TGF-β1-Smad2/3信号通路预防EMT和胶原沉积。
从EEAR中鉴定出结合TGF-β1的RA
通过LC-MS分析EEAR成分，在正负离子模式总离子流图中检测到EEAR含87种化合物，包括32种黄酮类、18种有机酸、15种苯丙酮类和8种倍半萜类。通过保留时间和质谱MS2碎片鉴定出RA、7-羟基香豆素、亚麻苷、白杨素B、青蒿素、D-(-)-奎尼酸、绿原酸、安布罗酸和甘草次酸等为EEAR成分。利用生物层干涉术（BLI）和LC-MS筛选鉴定EEAR中结合TGF-β1的化合物，发现活性成分是RA。RA以单电荷去质子化离子形式存在（[M-H], m/z 247.13），其MS2碎片主要产生m/z 203.14。通过定量分析RA标准品和EEAR样品的洗脱峰，确定EEAR含1.26% RA。分析小鼠血液和肺组织代谢成分，血液中鉴定出37种天然化学化合物，肺组织中鉴定出16种，且血液中大量RA转移至肺组织。这些结果表明EEAR中结合TGF-β1的成分是RA，其可通过代谢进入肺组织。
RA通过结合TGF-β1抑制其泛素化，预防EMT和胶原沉积
表面等离子共振（SPR）分析显示RA（3.125–70 μg/mL）以浓度依赖方式直接与TGF-β1相互作用，平衡解离常数（KD）为26.64 μg/mL。细胞热位移分析（CETSA）表明RA显著保护TGF-β1蛋白免于温度依赖性变性，证实RA直接结合TGF-β1蛋白。分子对接预测RA与TGF-β1蛋白（PDB: 1KLA）的GlyA46残基结合，结合能得分为-5.31 kcal/mol。分子动力学模拟显示TGF-β1/RA的均方根偏差（RMSD）稳定在0.3–0.4 nm，TGF-β1的RMSD稳定在0.2–0.3 nm，表明TGF-β1/RA与TGF-β1之间存在明显构象变化。同时，TGF-β1/RA的均方根波动（RMSF）相对较低，多数序列RMSF低于0.2 nm，表明蛋白系统相对稳定。TGF-β1/RA复合物结合能为-20.66 ± 2.16 kcal/mol。将RA（50 μg/mL）与TGF-β1（5 ng/mL）体外预混合1小时后诱导Beas-2B细胞，发现TGF-β1诱导的Beas-2B细胞中TGF-β1蛋白泛素化增加，但RA-TGF-β1混合物处理降低了泛素化，但不影响TGF-β1 mRNA。Western blot显示RA-TGF-β1混合物诱导的Beas-2B细胞中TGF-βR1、TGF-βR2和p-Smad2/3蛋白表达显著降低。这些数据直接证明RA通过结合TGF-β1抑制其泛素化并改变构象，阻止下游信号通路激活。α-SMA蛋白、胶原蛋白I蛋白和纤连蛋白mRNA表达被抑制。同时，RA-TGF-β1混合物抑制了MMP-2、MMP-12、TIMP-1和PAI-1的表达，并抑制了TGF-β1诱导的Beas-2B细胞迁移。总之，RA通过结合TGF-β1抑制其泛素化和构象改变，从而抑制TGF-β1-Smad2/3信号通路，进一步抑制TGF-β1诱导的EMT和胶原沉积，改善PF。
TGF-β1是RA抑制EMT和胶原沉积的关键靶点
为验证RA是否通过TGF-β1介导其效应，使用三种不同短发夹RNA（shRNA）敲低TGF-β1表达。shTGF-1、shTGF-2和shTGF-3显著降低Beas-2B细胞中TGF-β1水平。结果表明RA抑制CSE诱导的TGF-β1上调，从而抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路激活。该激活信号通路促进下游蛋白包括胶原蛋白I、α-SMA、MMP-2、MMP-12、TIMP-1和PAI-1以及纤连蛋白mRNA的表达，最终增强Beas-2B细胞迁移。然而，TGF-β1敲低后，RA抑制CSE诱导的TGF-β1/Smad2/3通路激活的能力显著降低，且RA对这些下游蛋白、纤连蛋白mRNA和细胞迁移的抑制作用减弱。同时，将TGF-β1上的GlyA46位点突变为丙氨酸。伤口愈合实验显示RA显著抑制转染野生型TGF-β1质粒的Beas-2B细胞迁移，而其抑制作用在转染突变型TGF-β1质粒的细胞中减弱。此外，RA失去了抑制突变型TGF-β1诱导的TGF-β1/Smad2/3信号通路激活的能力，但有效抑制了野生型TGF-β1诱导的激活。RA显著抑制野生型TGF-β1诱导的下游蛋白包括胶原蛋白I、MMP-12、MMP-2、PAI-1、TIMP-1和α-SMA的上调，但未能抑制突变型TGF-β1诱导的下游蛋白和纤连蛋白mRNA表达增加（除MMP-2和MMP-12外）。因此，TGF-β1及其GlyA46残基是RA抑制EMT和胶原沉积的直接靶点。
RA通过TGF-β1-Smad2/3通路预防CSE诱导的EMT和胶原沉积
为研究RA对PF中EMT和胶原沉积的抑制作用，建立了CSE体外模型。细胞活力实验显示RA在12.5、6.25和3.125 μg/mL浓度下提高细胞活力，阻止CSE诱导的细胞活力下降。研究TGF-β1-Smad2/3信号通路以确定RA机制，发现CSE显著增加p-Smad2/3和Smad2/3表达水平，而RA处理细胞表现出降低的p-Smad2/3和Smad2/3水平，表明RA阻止了TGF-β1-Smad2/3信号通路激活。同时，通过测量α-SMA、纤连蛋白和胶原蛋白I（PF的肌成纤维细胞标志物）表达来检查纤维化反应，结果显示RA抑制了CSE诱导的Beas-2B细胞中α-SMA和胶原蛋白I的表达以及纤连蛋白mRNA表达。同时，RA降低了MMP-2、MMP-12、TIMP-1和PAI-1蛋白的产生，从而抑制CSE诱导的Beas-2B细胞迁移。这些结果表明RA通过TGF-β1/Smad2/3信号通路预防CSE诱导的EMT和胶原沉积，缓解PF。
讨论
PF导致COPD中不可逆的肺损伤，每年在全球导致数百万人死亡和巨额医疗费用，对公共健康构成严重威胁。中药作为炎症和纤维化有效且安全的治疗方法，日益成为预防COPD中PF的焦点。岩蒿作为传统中药，具有清肺、润肺和抗炎作用，但其抗纤维化特性从未被研究。本研究探讨了EEAR对CS诱导的COPD中PF的作用和机制。在COPD中，PF是肺实变的关键因素，损害肺功能并加重气流受限。本研究建立CS诱导的小鼠模型研究EEAR的抗纤维化活性及其作为PF新疗法的潜力。结果表明，CS诱导的PF小鼠模型具有与人类PF相似的特征，如体重减轻、气道阻塞、肺功能障碍和胶原沉积。EEAR显著预防炎症、气道阻塞和胶原沉积。然而，DEX作为肺部炎症和PF的常用治疗方法，对CS暴露小鼠的气道阻塞、肺功能和胶原沉积无显著保护作用。此外，EEAR通过防止CS暴露导致的肺密度增加、提高PaO2水平和降低PaCO2水平显著改善肺功能。研究表明 prolonged inflammatory infiltration induces EMT and subsequent activation in epithelial cells, increasing Collagen I, α-SMA, MMP-12, and MMP-2 expression, leading to PF and exacerbating COPD。此外，TIMP-1和PAI-1是调节MMPs酶活性的重要因子。本研究发现EEAR阻止了CS暴露引起的MMP-12和MMP-2过表达，减少细胞外基质（ECM）降解，平衡肺组织中弹性纤维和胶原纤维，从而抑制PF。EEAR还阻止CSE诱导的Beas-2B细胞EMT，抑制胶原蛋白I、α-SMA、MMP-12、MMP-2、TIMP-1和PAI-1蛋白表达增加。总之，本研究表明EEAR是PF安全有效的治疗方法。为确定EEAR抗纤维化作用机制，进行了全面详细分析。炎症通过TGF-β1和NF-κB信号通路串扰增强TGF-β1过表达，从而促进PF发展。此外，在炎症刺激下，TGF-β1促进Smad蛋白与MUC5AC启动子结合，增加MUC5AC分泌、气道阻塞和气流受限，进一步限制肺功能。总之，研究表明TGF-β1在抑制PF中起关键作用。本研究发现EEAR通过调节TGF-β1/Smad2/3信号通路预防COPD中的PF并抑制肺实变。此外，它减轻了肺部炎症和过度MUC5AC表达引起的气道阻塞，改善肺功能。中药活性成分不明限制了其治疗COPD中PF的应用。识别和筛选中药提取物中治疗COPD的化学成分对临床药物开发至关重要。与既往研究一致，本研究证实岩蒿主要含黄酮类、有机酸和倍半萜类。通过分析血液中天然化学成分，RA、A2-A31和P1-P6被鉴定为EEAR的潜在活性成分。肺组织天然化学成分分析显示，肺中含量高的活性成分是RA、A4、A18、A8和A32，其中RA浓度最高。TGF-β1是研究最深入的促纤维化细胞因子，在PF发病机制中起核心调控作用。敲低实验证明TGF-β1是CSE诱导PF的关键蛋白。因此，靶向TGF-β1是保护PF过程中正常肺结构的有效策略。此外，前期结果表明EEAR通过调节TGF-β1/Smad2/3信号通路预防PF并抑制肺实变。因此，利用BLI和LC-MS筛选鉴定EEAR中结合TGF-β1的化合物，鉴定出EEAR中结合TGF-β1的活性成分RA。进行SPR和CETSA分析量化RA与TGF-β1的相互作用。此外，进行分子对接分析和分子动力学模拟阐明RA与TGF-β1的结合模式。RA与TGF-β1中的GlyA46相互作用，蛋白突变实验进一步支持。分子动力学模拟显示RA诱导TGF-β1构象变化，可能导致蛋白功能改变。体外实验进一步证实RA通过结合TGF-β1抑制其泛素化和构象改变，从而抑制TGF-β1-Smad2/3信号通路。最后，研究表明RA通过TGF-β1/Smad2/3信号通路预防CSE诱导的EMT和胶原沉积，缓解PF。总之，这些数据直接证明RA通过结合TGF-β1预防PF。
结论
本研究深化了对岩蒿预防PF和改善COPD肺损伤作用的理解，表明EEAR通过TGF-β1/Smad2/3信号通路预防CS诱导的EMT、纤维失衡，逆转胶原蛋白I、α-SMA、MMP-2、MMP-12、TIMP-1和PAI-1蛋白表达增加，从而预防COPD中的PF。鉴定出EEAR中结合TGF-β1的活性成分RA。RA通过抑制TGF-β1蛋白泛素化和改变构象调节TGF-β1-Smad2/3信号通路，从而抑制EMT和胶原沉积，治疗PF。因此，岩蒿及其活性成分RA是治疗COPD中PF的潜在临床药物，这些发现为COPD管理治疗药物的研发提供了参考。
