《Advanced Science》：Neddylation Targets and Stabilizes NLRP3 to Augment Inflammasome-Mediated Colitis and Mood Disorder
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本研究揭示了NLRP3炎症小体激活新机制：neddylation通过K287位点修饰稳定NLRP3，拮抗Trim31介导的K48泛素化降解，从而增强巨噬细胞炎症反应。研究发现，髓系特异性缺失UBA3或NEDD8可缓解DSS诱导的结肠炎及应激性焦虑，而neddylation抑制剂MLN4924通过抑制NLRP3炎症小体活化发挥治疗潜力。该工作为炎症相关疾病提供了新的治疗靶点。
2.1 Neddylation促进巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活
研究发现髓系特异性缺失UBA3（NEDD8活化酶E1的催化亚基）或NEDD8的小鼠，其骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）在LPS+ATP或LPS+MSU刺激后，IL-1β分泌显著减少，而TNF-α和IL-6分泌无变化。转录组分析和qRT-PCR证实NLRP3、pro-IL-1β等mRNA水平未受影响，但免疫印迹显示活化的Caspase-1和GSDMD N端片段生成减少，表明neddylation在转录后水平促进NLRP3炎症小体活化。
2.2 髓系Neddylation阻断使小鼠对DSS诱导的结肠炎产生抵抗
髓系特异性UBA3缺失（Uba3ΔMye）小鼠在DSS诱导的结肠炎模型中，体重减轻较少，疾病活动指数降低，结肠组织病理损伤减轻，结肠组织中IL-1β水平降低，而TNF-α和IL-6无显著变化。流式细胞术显示结肠浸润巨噬细胞数量无差异，但IB分析表明UBA3缺失小鼠结肠组织中成熟IL-1β水平降低，pro-IL-1β水平不变，证明neddylation通过调控NLRP3炎症小体活化影响结肠炎。
2.3 小胶质细胞诱导性Neddylation阻断缓解心理应激诱导的焦虑样行为
利用他莫昔芬诱导的Cx3cr1-CreERT2; Uba3F/F（Uba3-iKO）小鼠模型，研究发现心理应激（束缚应激）可增强杏仁核中P-JNK、NLRP3和成熟IL-1β水平，并导致突触蛋白Synaptophysin和PSD-95减少。而小胶质细胞特异性缺失UBA3可缓解应激诱导的焦虑样行为（高架十字迷宫和旷场实验），减少杏仁核中小胶质细胞标志物Iba1与M1极化标志物CD68的共标，降低成熟IL-1β水平，并缓解突触损失。
2.4 Neddylation维持NLRP3的蛋白水平
机制探讨发现，UBA3缺失并不影响NLRP3激动剂诱导的ROS生成，但增强JNK磷酸化。意外的是，UBA3或NEDD8缺失的BMDMs中NLRP3蛋白水平降低，而其mRNA水平不变。在DSS结肠炎模型和束缚应激模型的结肠组织及杏仁核组织中均观察到NLRP3蛋白水平降低，mRNA无变化。临床结肠炎组织样本免疫组化显示NEDD8与NLRP3水平呈正相关，提示neddylation在体内外均能稳定NLRP3蛋白。
2.5 NLRP3是Neddylation底物
通过组氨酸拉下实验证实，在HEK-293T细胞中过表达的Myc-NLRP3可被His-NEDD8共价修饰，且可被MLN4924抑制。在6×His-FLAG-NEDD8敲入小鼠的BMDMs中，内源性NLRP3存在neddylation修饰，而ASC、pro-Caspase-1、GSDMD和pro-IL-1β未检测到。质谱分析和点突变验证表明K287是主要neddylation位点。进一步研究发现Ube2M是neddylation E2，Smurf2是neddylation E3，它们与NLRP3相互作用，并促进其neddylation。
2.6 NLRP3的Neddylation拮抗其泛素化和降解
蛋白酶体抑制剂MG132可逆转UBA3缺失或MLN4924处理导致的NLRP3蛋白水平下降。Neddylation缺陷突变体K287R的蛋白水平低于野生型，且MLN4924处理不再影响其水平。在HEK-293T细胞中，MLN4924处理或K287R突变均抑制了NLRP3炎症小体的活化。机制上，neddylation阻断增强了内源性NLRP3的泛素化，特别是K48连接的多聚泛素化。Smurf2作为neddylation E3，并不介导K48泛素化，而Trim31作为K48泛素化E3，其与NLRP3的相互作用在neddylation阻断后增强，且能促进K287R突变体的泛素化。在UBA3缺失的BMDMs中敲低Trim31可部分恢复NLRP3蛋白水平及炎症小体活化，表明neddylation通过阻碍Trim31招募来抑制NLRP3的K48泛素化降解。
2.7 MLN4924缓解心理应激诱导的小胶质细胞炎症激活和焦虑样行为
体内实验表明，腹腔注射50 mg/kg MLN4924可缓解束缚应激诱导的小鼠焦虑样行为，减少杏仁核中小胶质细胞Iba1和CD68的共标，降低NLRP3和成熟IL-1β蛋白水平，并缓解突触蛋白的丢失。这表明抑制neddylation具有治疗应激相关精神疾病的潜力。
3 讨论
本研究首次确认NLRP3是真正的neddylation底物，其K287位点的neddylation由Ube2M/Smurf2催化，并通过空间阻碍效应抑制Trim31介导的K48泛素化降解，从而稳定NLRP3并促进炎症小体活化。髓系或小胶质细胞neddylation缺失可缓解小鼠结肠炎和焦虑样行为。Neddylation抑制剂MLN4924在临床前模型中显示出治疗潜力，为炎症性疾病提供了新策略。
