PM2.5通过PTG依赖性糖原代谢紊乱抑制脂肪组织棕色化：揭示环境污染物致代谢紊乱的新机制

《Advanced Science》：PTG-Dependent Glycogen Metabolic Dysfunction Drives Impaired Adipose Browning: A Novel Mechanism Linking PM2.5 to Metabolic Disorders

本研究揭示了细颗粒物（PM2.5）暴露通过下调蛋白靶向糖原（PTG）破坏腹股沟白色脂肪组织（iWAT）糖原稳态，进而抑制脂肪棕色化和线粒体功能的新机制。研究首次确立了ADRB3-PTG-VEGFB信号轴在PM2.5诱导代谢功能障碍中的核心地位，为环境相关性代谢疾病提供了新的治疗靶点。

　　

1 引言

细颗粒物（PM_2.5）作为关键的环境污染物，其与代谢综合征易感性增加之间的关联已被广泛证实。作为人体最大的内分泌器官，脂肪组织在代谢调节中发挥基础作用。其中，腹股沟白色脂肪组织（iWAT）通过寒冷暴露或β-肾上腺素能受体刺激获得棕色脂肪组织（BAT）样产热能力，这一棕色化过程通过解偶联蛋白1（UCP1）依赖性产热增强能量消耗。既往研究虽证实PM_2.5暴露显著损害白色脂肪组织（尤其是iWAT）棕色化，但其精确分子机制尚不清楚。

糖原作为哺乳动物主要的葡萄糖储存聚合物，是重要的能量储备。毒理学证据表明PM_2.5暴露会减少肝糖原储存并抑制肝糖原合成。尽管脂肪组织通常比肝脏或肌肉维持较低的基础糖原含量，但在禁食-再喂养周期中表现出动态的糖原波动，提示其参与急性代谢调节。蛋白靶向糖原（PTG），由Ppp1r3c编码并在脂肪细胞中高表达，是蛋白磷酸酶-1（PP1）的关键调节亚基，协调糖原合成。近期研究发现脂肪细胞特异性PTG缺失会降低米色脂肪细胞糖原含量，损害UCP1表达，并减弱肥胖小鼠中寒冷或β-肾上腺素能受体刺激的体重减轻。然而，PTG在PM_2.5介导的iWAT棕色化损伤中的潜在作用尚未被研究。

β3-肾上腺素能受体（ADRB3）是棕色和米色脂肪细胞内适应性产热的关键介质。作者前期工作发现ADRB3甲基化及其后续下调是PM_2.5损害iWAT棕色化的关键机制。有研究表明β-肾上腺素能信号传导增强了PTG转基因小鼠模型中的糖原周转，提示了β-肾上腺素能信号与糖原代谢之间的串扰。然而，ADRB3是否通过PTG调节的糖原代谢介导PM_2.5抑制的iWAT棕色化仍属未知。

本研究采用全身吸入暴露系统研究PM_2.5对iWAT棕色化和糖原代谢的影响。通过整合体内外方法，阐明了PTG在介导PM_2.5抑制iWAT棕色化中的核心作用。数据库预测和后续验证支持了一个涉及ADRB3-PTG-VEGFB信号通路的新型调节轴。

2 结果

2.1 PM_2.5特征

研究中使用的全身吸入暴露系统是一种经过验证的PM_2.5暴露建模方法。该系统直接采样环境室外空气，每日PM_2.5暴露浓度动态反映室外空气质量波动，从而准确模拟真实世界的人类暴露模式和场景。在过滤空气（FA）舱和PM_2.5舱中，小鼠暴露的平均每日PM_2.5浓度分别为2.15 ± 0.47 μg/m³和40.18 ± 4.70 μg/m³。PM_2.5成分分析显示，在水溶性无机离子、金属元素和非金属元素中，硫酸盐（SO₄^2?）、铝（Al）和砷（As）分别是最丰富的物种。

2.2 PM_2.5暴露抑制全身代谢和iWAT棕色化

首先研究了PM_2.5暴露对全身代谢的影响。虽然PM_2.5暴露未显著影响小鼠体重，但显著增加了体重增长。PM_2.5暴露小鼠的脂肪量及其与体重的比率也显著增加。腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）显示，PM_2.5暴露小鼠在葡萄糖给药后60分钟血糖水平和曲线下面积（AUC）显著更高。PM_2.5暴露后，产热被显著抑制，证实PM_2.5暴露引起小鼠代谢紊乱。

随后深入探究了PM_2.5暴露对iWAT棕色化的影响。PM_2.5暴露显著增加了iWAT的质量和器官系数。苏木精-伊红（H&E）染色显示PM_2.5暴露改变了iWAT形态，表现为脂肪细胞尺寸增大。与脂肪细胞产热和米色脂肪细胞相关的标志分子（如Ucp1、CD137、Cidea、Cox8b和Pgc1α）的mRNA表达在PM_2.5暴露小鼠的iWAT中高度下调。免疫组织化学和蛋白质印迹分析均显示PM_2.5诱导的iWAT中UCP1表达显著降低。在细胞水平上，不同浓度的PM_2.5也显著抑制了3T3-L1脂肪细胞中产热基因的mRNA表达和UCP1蛋白表达。这些发现表明PM_2.5暴露抑制了iWAT棕色化。

2.3 PM_2.5暴露抑制iWAT中的糖原代谢

为阐明PM_2.5暴露对iWAT糖原代谢的影响，评估了iWAT中的糖原含量，观察到PM_2.5暴露后糖原水平显著降低。高碘酸-雪夫（PAS）染色显示PM_2.5暴露后糖原积累减少。

由于PTG是协调糖原代谢的关键支架蛋白，研究了其在PM_2.5暴露后小鼠iWAT和3T3-L1脂肪细胞中的表达。PM_2.5暴露导致小鼠iWAT中Ppp1r3c的mRNA表达水平和PTG蛋白表达水平显著降低。分析显示小鼠iWAT中Ppp1r3c的mRNA表达与Ucp1的mRNA表达呈显著正相关。与此一致，PM_2.5暴露也以浓度依赖性方式显著降低了3T3-L1脂肪细胞中Ppp1r3c的mRNA水平和PTG的蛋白水平。此外，在3T3-L1脂肪细胞中，Ppp1r3c和Ucp1的mRNA表达水平也呈正相关。

鉴于PTG在糖原代谢中的核心作用，进一步检测了小鼠iWAT中糖原合成和分解限速酶的表达水平。PM_2.5暴露显著降低了肝糖原合成酶（hGS，由Gys2编码）的mRNA和蛋白水平，肌糖原合成酶（mGS，由Gys1编码）的mRNA和蛋白水平也呈现下降趋势。相比之下，糖原分解酶的表达水平保持不变，表明PM_2.5暴露后iWAT中糖原合成酶下调。

这些结果表明PTG表达降低可能导致PM_2.5抑制的糖原合成，最终导致iWAT糖原含量减少。

2.4 PTG过表达改善PM_2.5诱导的iWAT糖原代谢失调

通过原位注射AAV9建立了特异性PTG过表达小鼠模型（AAV9-PTG），随后进行PM_2.5暴露。验证显示AAV9-PTG小鼠iWAT中Ppp1r3c的mRNA水平增加了约106倍，PTG蛋白水平显著上调，证实模型构建成功。

随后研究了PTG过表达对PM_2.5暴露小鼠iWAT糖原代谢的调节作用。发现PTG过表达显著提高了小鼠iWAT中的糖原含量，并有效缓解了PM_2.5暴露诱导的糖原含量减少。PAS染色进一步证实了这一现象。PTG过表达显著上调了糖原合成酶亚型（Gys1, Gys2）的mRNA表达水平，并有效抵消了PM_2.5诱导的这些基因在小鼠iWAT中的减少。此外，它还显著提高了小鼠iWAT中mGS和hGS的蛋白表达水平，并有效逆转了PM_2.5暴露引起的hGS蛋白表达下调。

在3T3-L1脂肪细胞中，通过腺病毒转染建立了PTG过表达（Ad-PTG）细胞模型，然后暴露于PM_2.5。验证显示在Ad-PTG细胞中，Ppp1r3c的mRNA水平增加了约10倍，伴随PTG蛋白水平显著升高，证实PTG过表达细胞模型成功建立。PTG过表达显著增加了hGS的mRNA和蛋白水平，并逆转了PM_2.5诱导的3T3-L1脂肪细胞中hGS的下调。

总之，这些发现表明PTG过表达通过调节糖原合成酶（特别是hGS）的表达，显著增强了被PM_2.5暴露抑制的iWAT中的糖原含量。

2.5 PTG过表达减轻PM_2.5诱导的全身代谢功能障碍和iWAT棕色化损伤

研究了PTG过表达对PM_2.5暴露小鼠全身代谢的影响。虽然各组体重变化轨迹无差异，但PTG过表达显著抑制了小鼠体重增长，并有效减轻了PM_2.5诱导的体重增长增加。PM_2.5暴露诱导的脂肪量及其与体重比率的增加在PTG过表达小鼠中得到显著减轻。此外，PTG过表达不仅显著增强了葡萄糖耐量，而且逆转了PM_2.5暴露引起的小鼠葡萄糖耐量受损。能量代谢进一步分析显示，PTG过表达对白天总产热无显著影响，但显著增加了夜间活动峰值时的总产热，并缓解了PM_2.5暴露引起的产热减少。这些发现表明PTG过表达可显著改善PM_2.5暴露诱导的小鼠全身代谢紊乱，包括脂肪代谢、葡萄糖代谢和能量代谢。

进一步评估了PTG过表达对PM_2.5暴露小鼠iWAT产热功能的影响。PM_2.5暴露诱导的iWAT质量和器官系数的增加被PTG过表达有效减轻。H&E染色进一步证实PTG过表达显著减小了iWAT中脂肪细胞的尺寸，并有效逆转了PM_2.5暴露诱导的细胞肥大。红外热成像结果显示，与各自对照组相比，PTG过表达显著提高了FA和PM_2.5暴露小鼠iWAT的局部温度。qRT-PCR结果显示PTG过表达显著上调了Ucp1、CD137、Cox8b和Pgc1α的mRNA表达水平。AAV9-PTG-PM_2.5组中Ucp1、Dio2和Pgc1α的mRNA表达水平显著高于AAV9-GFP-PM_2.5组。免疫组织化学和蛋白质印迹结果进一步证实PTG过表达显著上调了UCP1蛋白表达水平，并有效逆转了PM_2.5暴露诱导的UCP1表达下降。这些结果表明PTG过表达显著改善了PM_2.5损伤的小鼠iWAT产热功能。

随后在细胞水平进行了验证。PTG过表达显著增加了3T3-L1脂肪细胞中Ucp1、CD137、Cox8b和Pgc1α的mRNA表达水平。此外，它有效抵消了PM_2.5抑制的这些基因的表达，尽管Dio2和Cidea的水平保持不变。蛋白质印迹分析进一步证实PTG过表达显著增加了UCP1蛋白表达，并有效逆转了PM_2.5触发的3T3-L1脂肪细胞中UCP1蛋白水平的降低。

为进一步验证糖原在iWAT棕色化过程中的作用，用不同浓度的糖原处理3T3-L1脂肪细胞。随着糖原浓度增加，3T3-L1脂肪细胞中UCP1蛋白的表达水平显著增加。这些发现表明增加糖原含量可显著促进3T3-L1脂肪细胞的棕色化过程，并进一步证实了PTG通过调节糖原代谢在iWAT棕色化中发挥重要作用的分子机制。

2.6 PTG过表达减轻PM_2.5诱导的iWAT线粒体功能障碍

线粒体作为细胞能量代谢的核心场所，在iWAT棕色化过程中起着关键作用。进一步研究了PTG过表达对PM_2.5暴露小鼠iWAT线粒体功能的影响。透射电子显微镜显示PM_2.5暴露导致iWAT线粒体嵴结构紊乱，而PTG过表达显著改善了线粒体嵴结构的完整性。它还增加了iWAT中的线粒体数量，并有效缓解了PM_2.5暴露诱导的线粒体数量减少。

随后分析了线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）组分的表达水平，包括复合物I-IV和ATP合酶（复合物V）。PTG过表达显著上调了OXPHOS相关基因的mRNA表达水平，包括NADH脱氢酶铁硫蛋白9（Ndufb9）、琥珀酸脱氢酶复合体亚基B（Sdhb）、泛醇-细胞色素c还原酶R亚基B（Uqcrb）、细胞色素c氧化酶亚基5A（Cox5a）和ATP合酶亚基5A1（Atp5a1）。值得注意的是，PTG过表达显著逆转了PM_2.5诱导的Ndufb9、Uqcrb、Cox5a和Atp5a1mRNA表达下调。蛋白质印迹进一步证实，与AAV9-GFP-FA组相比，AAV9-PTG-FA组中NDUFB9、UQCRFS1和COX5A的蛋白表达水平显著更高。同时，NDUFB9、SDHA、UQCFS1和COX5A的蛋白表达水平被PM_2.5暴露下调，这些在PTG过表达后显著增加，而ATPB的表达水平未显著改变。

然后在细胞水平验证了结果。O2K检查显示，在0 μg/mL或100 μg/mL PM_2.5处理条件下，PTG过表达显著增加了3T3-L1脂肪细胞的基础呼吸、最大呼吸和ATP产量。值得注意的是，PTG过表达显著缓解了PM_2.5暴露引起的最大呼吸减少。然而，各组间的质子漏水平无显著差异。此外，PTG过表达显著上调了NDUFB9、UQCRFS1、COX5A和ATPB的蛋白水平，并有效改善了PM_2.5诱导的NDUFB9、SDHA、COX5A和ATPB蛋白水平下降。

总之，PTG过表达通过增强线粒体形态、数量和功能，在维持PM_2.5暴露后iWAT棕色化中发挥了关键作用。

2.7 VEGFB介导PTG过表达对PM_2.5损伤iWAT棕色化的保护作用

为阐明糖原代谢在PM_2.5暴露抑制iWAT棕色化中的作用机制，使用GeneMANIA数据库对核心分子Ppp1r3c和Ucp1进行了基因相互作用网络分析。从得到的网络中，筛选出候选分子短名单，其中血管内皮生长因子（VEGF）被确定为潜在的分子靶点。验证发现VEGFB（VEGF家族成员）是糖原代谢的关键调节因子，而非其他分子。

进一步证实PTG过表达显著降低了iWAT和3T3-L1脂肪细胞中的VEGFB蛋白水平，而PTG敲低则增加了3T3-L1脂肪细胞中的VEGFB表达。值得注意的是，PM_2.5暴露上调了iWAT和3T3-L1脂肪细胞中的VEGFB蛋白水平，这一效应被PTG过表达抵消。此外，升高的糖原浓度抑制了3T3-L1脂肪细胞中的VEGFB蛋白表达，而VEGFB敲低并未改变PTG表达，清楚地表明PTG通过糖原对VEGFB表达的调节。

为阐明VEGFB在PM_2.5暴露抑制iWAT棕色化反应中的作用，通过siRNA转染建立了VEGFB敲低细胞模型。VEGFB敲低显著上调了Ucp1、CD137、Dio2、Cox8b和Pgc1α的mRNA水平。此外，它有效抵消了PM_2.5诱导的Ucp1、CD137和Pgc1αmRNA水平下调。蛋白质印迹分析进一步显示VEGFB敲低本身导致UCP1蛋白水平显著增加，并显著逆转了PM_2.5暴露对UCP1表达的抑制。

此外，VEGFB敲低显著提高了OXPHOS分子（包括Ndufb9、Sdhb、Uqcrb和Cox5a）的mRNA水平，并有效缓解了PM_2.5诱导的Ndufb9、Uqcrb和Cox5a的减少。在蛋白水平上，VEGFB敲低仅增加了NDUFB9和COX5A的蛋白表达，而它显著改善了PM_2.5诱导的NDUFB9、SDHA、UQCRFS1和COX5A蛋白表达下调。然而，各组间Atp5a1mRNA或ATPB蛋白的表达水平保持不变。总之，VEGFB敲低可通过增强产热功能和改善线粒体氧化磷酸化，有效缓解PM_2.5暴露对3T3-L1脂肪细胞棕色化的抑制作用。

2.8 ADRB3作为PM_2.5抑制iWAT棕色化中PTG的上游调节因子

作者前期发现表明ADRB3信号传导是PM_2.5暴露损害iWAT棕色化的关键分子机制。接下来分析了ADRB3是否通过调节PTG和VEGFB参与PM_2.5抑制的iWAT棕色化。

使用CL316243上调ADRB3信号的小鼠模型和ADRB3过表达的3T3-L1细胞模型，证明ADRB3的激活和过表达均显著上调了3T3-L1脂肪细胞中PTG的蛋白表达水平和糖原含量，同时显著下调了VEGFB的蛋白表达水平。进一步研究表明，在ADRB3激动剂处理的小鼠模型和ADRB3过表达的细胞模型中，PM_2.5下调的PTG蛋白水平均被显著逆转。类似地，PM_2.5暴露显著上调的VEGFB蛋白表达也被ADRB3激活和过表达所逆转。然而，PTG过表达并未改变iWAT或脂肪细胞中ADRB3的蛋白水平。总之，这些结果表明ADRB3可能作为PTG的上游调节因子，正向调节PTG表达，继而抑制VEGFB表达。

随后全面评估了增强ADRB3活性对PM_2.5暴露小鼠iWAT棕色化的影响。在FA和PM_2.5暴露条件下，ADRB3激活均显著上调了小鼠iWAT中Ucp1、CD137、Dio2和Cidea的mRNA表达水平。蛋白质印迹进一步证实，增加的ADRB3活性不仅显著提高了小鼠iWAT中UCP1的蛋白水平，而且有效逆转了PM_2.5暴露诱导的UCP1蛋白表达下调。

在3T3-L1脂肪细胞中，ADRB3过表达显著上调了Ucp1、CD137、Dio2和Pgc1α的mRNA水平。此外，它有效逆转了PM_2.5暴露引起的Ucp1、CD137、Cox8b和Pgc1α基因表达下降。蛋白质印迹进一步证实ADRB3过表达显著增加了3T3-L1脂肪细胞中UCP1的蛋白水平，并减轻了PM_2.5暴露诱导的下调。这些发现表明ADRB3激活和过表达可通过PTG-VEGFB信号通路改善PM_2.5暴露诱导的iWAT棕色化功能障碍。

3 讨论

本研究提供了关于PM_2.5暴露如何破坏糖原代谢以抑制iWAT棕色化的机制见解，为解决PM_2.5相关代谢紊乱提供了新视角。基于作者先前证明PM_2.5诱导iWAT棕色化抑制和代谢功能障碍的发现，本研究现在提出以下关键发现：PM_2.5暴露显著损害iWAT中的糖原代谢。PTG过表达不仅挽救了PM_2.5诱导的iWAT糖原代谢失调，而且减轻了iWAT中的产热损伤、线粒体功能障碍和棕色化能力受损，以及全身代谢功能障碍。ADRB3-PTG-VEGFB信号轴是PM_2.5诱导代谢缺陷和脂肪棕色化抑制的机制框架。这些发现首次证明PM_2.5通过糖原代谢失调破坏脂肪棕色化。重要的是，我们的工作通过强调PTG介导的糖原代谢作为抵消空气污染暴露代谢后果的核心，揭示了一种新的“污染-剖析-保护”范式。

本研究首次揭示PM_2.5暴露显著损害iWAT中的糖原代谢