《Advanced Science》：Connexin 26 Functions as a Direct Transcriptional Regulator During the Cochlea Development
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本文突破性地揭示了Connexin 26（Cx26）在耳蜗发育中的非经典功能：其通过核定位直接结合基因组DNA启动子区，调控TSPANC8家族基因（如TSPAN5/15/17）的转录，进而影响ADAM10成熟及P-钙黏蛋白（P-cadherin）降解，最终调控柯蒂氏隧道（TC）的结构形成与听力发育。研究不仅颠覆了Cx26仅作为间隙连接通道的传统认知，更为GJB2突变所致先天性耳聋提供了新的治疗策略（如T3激素干预）。
2.1 间隙连接通道功能障碍并非TC结构异常和Cx26缺陷相关性先天性耳聋的主要机制
研究通过Cx26条件性敲除（cKO）小鼠模型证实，其出生后18天（P18）出现全频率重度听力损失，且耳蜗柯蒂氏隧道（TC）结构发育异常。为验证间隙连接通道功能是否为主要致病机制，研究者对新生小鼠连续腹腔注射经典间隙连接抑制剂卡宾氧酮（CBX），发现即使有效抑制Cx26通道功能，TC结构仍正常发育，且小鼠未出现显著听力损失。这表明Cx26缺陷导致的先天性耳聋主要源于其通道功能以外的机制。
2.2 Cx26在体内外均聚集于细胞核
通过Western blot检测小鼠耳蜗亚细胞组分，发现Cx26蛋白（约25 kDa）存在于核组分中。免疫荧光染色进一步显示，Cx26在耳蜗支持细胞及多种细胞系（BxPC-3、HEK293T-Cx26、HeLa-Cx26）中均存在核内聚集现象。核质分离实验结合GAPDH（胞质标记物）和组蛋白H3（核标记物）验证了Cx26的核定位。测序结果排除BxPC-3细胞中GJB2基因突变干扰，证实野生型Cx26具备核定位能力。
2.3 Cx26直接结合核蛋白与基因组DNA
免疫共沉淀-质谱联用（IP-MS）筛选出12种与Cx26相互作用的核蛋白，其中8种定位于核内，功能涉及RNA剪接、染色质转录复制等。染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）显示，Cx26结合峰有9.28%位于启动子-转录起始点（TSS）区域，1.52%直接重叠TSS区域。基序分析预测出Cx26潜在结合DNA序列，GO富集分析提示其参与DNA复制、GTP酶信号转导等通路。
2.4 Cx26作为TSPAN5、TSPAN15和TSPAN17的直接转录调控因子
空间转录组学（ST）和RNA-seq分析发现，Cx26 cKO小鼠耳蜗中TSPANC8家族基因（尤其是TSPAN5、TSPAN15、TSPAN17）mRNA水平显著下降。体外实验证实，Cx26敲低可降低这些基因表达，而过表达则增强其启动子活性。双荧光素酶报告基因实验显示，Cx26过表达使TSPAN5、TSPAN15、TSPAN17启动子活性分别提升401.47%、177.54%和64.24%。ChIP-qPCR进一步验证Cx26直接结合这些基因的启动子区。
2.5 Cx26通过转录调控TSPANC8/ADAM10复合物调控柯蒂氏隧道结构发育
Co-IP实验证实TSPAN5、TSPAN15、TSPAN17与ADAM10在耳蜗内存在相互作用。Cx26缺陷导致成熟ADAM10蛋白水平下降47.01%，前体ADAM10增加34.60%，但总ADAM10无显著变化。免疫荧光显示Cx26 cKO小鼠耳蜗中ADAM10表达降低71.71%。抑制ADAM10活性可延迟P-钙黏蛋白降解，阻碍内外柱细胞（IPCs/OPCs）分离，导致TC开放失败。而T3激素处理可通过提升ADAM10表达，促进P-钙黏蛋白破坏，挽救Cx26缺陷引起的TC结构异常。
2.6 调控ADAM10表达可挽救Cx26缺陷导致的TC结构发育异常与听力损失
皮下注射T3可显著提高血清FT3、FT4水平，并增强耳蜗ADAM10转录。在Cx26 cKO小鼠中，T3处理使成熟ADAM10蛋白恢复至正常水平，促进P-钙黏蛋白降解及TC开放。听觉脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）检测显示，T3处理组小鼠听力阈值显著改善，耳蜗放大功能接近野生型。组织学分析证实T3可挽救Cx26缺陷导致的毛细胞损失，尤其在中转区域外毛细胞存活率提升76.12%。
3 讨论
本研究首次揭示Cx26通过核定位直接调控基因转录的新功能，其机制涉及TSPANC8/ADAM10/P-钙黏蛋白轴调控耳蜗TC发育。Cx26缺陷引起的先天性耳聋主要源于TC结构发育异常，而非间隙连接通道功能丧失。T3干预可通过上调ADAM10表达部分挽救听力损失，为GJB2突变耳聋提供了潜在治疗策略。研究还提示Cx26核定位可能依赖其N端结构域，且不同截短突变体可能影响其转录调控功能，这为表型异质性提供了分子解释。
