《Advanced Science》：Endothelial Cell-Specific Molecule-1 (ESM1): An Endogenous Anticoagulant and Protective Factor in Venous Thrombosis
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本研究揭示了内皮细胞特异性分子-1（ESM1）作为内源性抗凝剂在静脉血栓栓塞症（VTE）中的关键作用。通过临床队列、斑马鱼及小鼠模型，文章证实ESM1通过其硫酸皮肤素（DS）侧链激活肝素辅因子II（HCII），从而抑制凝血酶活性。血清ESM1水平在VTE患者中显著升高，且与D-二聚体联合可提升诊断准确性。该发现为VTE的病理机制提供了新见解，并提示ESM1作为潜在治疗靶点与生物标志物的临床价值。
1 引言
静脉血栓栓塞症（VTE）是一种患病率高、死亡率高的心血管疾病，其早期诊断和干预对于降低死亡率至关重要。凝血级联反应是血液凝固的核心过程，其活性受到内源性抗凝途径的精密调控。内皮细胞特异性分子-1（ESM1），也称为内根皮素，是一种主要由内皮细胞分泌的硫酸皮肤素（DS）蛋白聚糖。尽管临床观察发现VTE患者血清中ESM1水平显著升高，但其在凝血调节中的具体作用机制尚不明确。本研究旨在通过整合临床分析、斑马鱼和小鼠模型以及生化实验，探讨ESM1在体内如何影响血栓形成和凝血过程。
2 结果
2.1 ESM1水平与VTE患者D-二聚体水平呈正相关
本研究共纳入160名参与者，包括98名VTE患者和62名健康对照。结果显示，VTE患者血清ESM1浓度（498.54 ± 229.47 pg/mL）显著高于健康对照（198.68 ± 89.62 pg/mL）。ESM1诊断VTE的曲线下面积（AUC）为0.899，当其与D-二聚体联合使用时，诊断准确性进一步提高（AUC = 0.955）。ESM1水平与D-二聚体水平呈正相关，表明其作为VTE生物标志物的潜力。
2.2 ESM1主要在微血管内皮细胞中表达
通过分析人类和小鼠的单细胞RNA测序数据集，发现ESM1在不同物种的微血管内皮细胞中特异性高表达。斑马鱼原位杂交实验进一步证实，esm1在节间血管（ISVs）和背纵吻合血管（DLAV）等微血管结构中强烈表达。
2.3 Esm1基因敲除突变体的构建
利用CRISPR/Cas9技术成功构建了两种斑马鱼esm1敲除突变体（esm1ntu28和esm1ntu29）。这两种突变体均导致阅读框移位和提前终止密码子，产生缺乏关键糖基化位点的截短蛋白。突变体在发育早期未见明显异常，但从10天受精后（dpf）开始表现出存活率下降。
2.4 Esm1功能缺失对出芽 angiogenesis无明显影响但导致凝血级联改变
与先前研究不同，本研究发现esm1敲除斑马鱼的血管发育，包括ISV的长度、直径以及内皮细胞迁移和增殖，均未受到显著影响。然而，全基因组转录组分析显示，esm1缺失显著富集了补体和凝血级联通路，提示其可能参与凝血过程的调节。
2.5 Esm1功能缺失导致血流速度减慢和血栓形成
尽管血管形态正常，但esm1敲除突变体的主静脉（CV）中血流速度显著降低。O-联茴香胺染色显示，突变体心脏区域红细胞减少，而尾静脉中红细胞聚集增加，表型类似于苯肼（PHZ）诱导的血栓模型。向突变体注射esm1mRNA可挽救这些表型。
2.6 Esm1是抗凝所必需且其过表达足以增强抗凝能力
通过测量刺伤后主静脉的闭塞时间（TTO），发现esm1敲除突变体的TTO显著短于野生型。向突变体注射esm1mRNA可延长TTO。在野生型斑马鱼中过表达esm1也能剂量依赖性地延长TTO，证明Esm1在体内具有抗凝活性。
2.7 共价连接的DS糖胺聚糖对Esm1的抗凝活性至关重要
将糖基化位点突变的esm1S138AmRNA注入突变体或野生型斑马鱼，均无法改变TTO。然而，直接向主静脉注射DS可以挽救突变体的TTO表型，并在野生型中剂量依赖性地延长TTO。体外实验表明，重组人ESM1蛋白在肝素辅因子II（HCII）存在下能抑制凝血酶活性，但其DS链被软骨素酶ABC消化后，该活性消失。在Esm1敲除（Esm1ko/ko）小鼠中，观察到出血时间、活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）缩短，而注射重组人ESM1蛋白可以挽救这些凝血功能异常。
3 讨论
本研究首次揭示了ESM1作为一种新型内源性抗凝剂，通过其DS链激活HCII来抑制凝血酶，从而在静脉血栓形成中发挥保护作用。VTE患者中ESM1水平升高可能是一种代偿性反应，以对抗血栓形成。ESM1与D-二聚体联合使用有望提高VTE的诊断准确性。研究结果不仅深化了对内源性抗凝途径的理解，也为开发针对ESM1-HCII轴的新型抗血栓策略提供了理论依据。
4 实验方法
研究获得了南通大学附属医院的伦理批准。临床样本来自VTE患者和健康对照。斑马鱼和小鼠模型用于体内功能研究。实验方法包括ELISA、原位杂交、CRISPR/Cas9基因编辑、血流分析、TTO测定、小鼠尾静脉出血时间测量以及体外抗凝血酶活性测定等。统计学分析采用Student's t检验、单因素方差分析（ANOVA）等方法。
