《Advanced Science》：CRISPLD2 Attenuates Intervertebral Disc Degeneration by Suppressing Oxidative Stress-Induced Ferroptosis through the miR-548I-IL17A Axis
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本文揭示了CRISPLD2通过调控miR-548I-IL17A轴抑制氧化应激诱导的铁死亡，从而延缓椎间盘退变（IVDD）的新机制。研究发现CRISPLD2缺失会下调miR-548I表达，导致IL17A上调，促进髓核细胞（NPCs）铁死亡和椎间盘退变。通过单细胞测序、动物模型和分子实验验证，该研究为IVDD的治疗提供了新的靶点（CRISPLD2-miR-548I-IL17A轴）和潜在策略（如AAV介导的基因治疗）。
2.1 单细胞转录组分析揭示CRISPLD2与IVDD和铁死亡的关联
通过分析单细胞RNA测序数据，研究发现退行性髓核细胞亚群富集了铁代谢和脂质过氧化相关基因。CRISPLD2敲低会导致氧化还原失衡、脂质过氧化物升高和铁积累，促进铁死亡。伪时间轨迹分析显示CRISPLD2在退变过程中呈动态变化，NPC3（轻度退变）中表达最高，NPC4（重度退变）中降低。GO富集分析显示NPC3和NPC4中铁相关术语和脂质代谢通路显著富集，且铁死亡通路活性存在亚型特异性差异。CRISPLD2与铁死亡关键基因（如ACSL4、GPX4、FTH1）相关，表明其可能通过调节氧化应激和铁死亡参与IVDD。
2.2 CRISPLD2在重度退行性髓核细胞中表达下调
人类椎间盘组织分析显示，CRISPLD2在轻度退变（Pfirrmann III级）组织中表达暂升，在重度退变（IV-V级）中显著降低，且与患者疼痛评分（VAS）负相关。小鼠模型（LSI和CINS）中，Crispld2缺失导致Acan下调、Mmp3上调，椎间盘结构破坏，证实CRISPLD2表达与IVDD严重程度相关。
2.3 高浓度或长期IL-1β暴露降低NPCs中CRISPLD2表达
IL-1β处理人NPCs后，CRISPLD2表达呈时间依赖性（短期升高，长期降低）和剂量依赖性（低浓度升高，高浓度降低）。同时，细胞外基质（ECM）降解标志物（MMP3、ADAMTS5）上调，合成标志物（ACAN、COL2A1）下调，提示CRISPLD2参与炎症微环境调控。
2.4 Crispld2缺陷促进IVDD和疼痛相关行为
髓核特异性Crispld2敲除（cKO）小鼠椎间盘出现基质紊乱、蛋白聚糖丢失，MRI显示信号强度降低。Western blot和免疫荧光显示Crispld2缺失导致Acan、Col2a1下调，Mmp3、Adamts5上调。行为学实验表明cKO小鼠运动距离、最大速度和压痛耐受性下降，提示疼痛敏感性增加。
2.5 Crispld2缺陷通过线粒体功能障碍和氧化应激促进铁死亡
Crispld2缺失的NPCs中谷胱甘肽（GSH）、NADPH水平降低，氧化型谷胱甘肽（GSSG）、丙二醛（MDA）升高，线粒体形态异常（嵴丢失、膜密度增加）。FerroOrange、ROS和MitoSOX染色显示铁积累、活性氧和线粒体超氧化物增加，脂质过氧化（BODIPY）增强。铁死亡相关蛋白（GPX4、FTH1下调，ACSL4上调）进一步证实Crispld2缺失促进铁死亡。
2.6 CRISPLD2下调激活IL17A通路
RNA测序显示CRISPLD2敲低后873个基因差异表达，KEGG和GSEA分析富集到IL17信号通路和铁死亡。实验验证CRISPLD2敲低上调IL17A mRNA和蛋白，而过表达CRISPLD2则抑制IL17A，表明CRISPLD2通过转录后调控抑制IL17A。
2.7 CRISPLD2通过调控IL17A表达调节铁死亡
在CRISPLD2敲低的NPCs中，抑制IL17A可逆转氧化应激指标（GSH/GSSG、NADPH、MDA）异常，降低铁积累、ROS和脂质过氧化，并改善线粒体形态。脂质组学分析显示PE（18:0/20:4）和PE（18:0/22:4）在CRISPLD2敲低时升高，IL17A抑制后回调，证实CRISPLD2-IL17A轴调控磷脂过氧化。
2.8 CRISPLD2通过miR-548I靶向调控IL17A
miRNA测序发现CRISPLD2敲低后miR-548I显著下调。双荧光素酶报告实验证实miR-548I直接结合IL17A的3‘-UTR抑制其表达。功能实验显示miR-548I模拟物可逆转CRISPLD2敲低引起的IL17A上调，而抑制剂则抵消CRISPLD2过表达对IL17A的抑制，确立CRISPLD2-miR-548I-IL17A调控轴。
2.9 MiR-548I通过调控IL17A抑制铁死亡
过表达IL17A可抵消miR-548I模拟物对氧化应激和铁死亡的保护作用，而敲低IL17A则缓解miR-548I抑制剂加剧的铁死亡，表明miR-548I通过靶向IL17A调控铁死亡。
2.10 Crispld2过表达缓解退变表型和疼痛行为，IL17A过表达逆转此效应
AAV介导的Crispld2过表达可改善小鼠椎间盘结构，降低IL17A、Mmp3和4HNE表达，缓解疼痛行为；而共过表达IL17A则逆转这些保护作用，证实Crispld2-IL17A轴在IVDD中的关键作用。
2.11 Crispld2缺陷通过痛觉过敏和伤害性输入增强导致椎间盘源性疼痛
Crispld2缺失的NPCs与背根神经节（DRG）神经元共培养时，促进神经元突起生长和分支，疼痛相关神经肽（CGRP、P物质）表达上调。体内实验显示cKO小鼠DRG中CGRP和P物质升高，表明Crispld2缺失通过促进神经长入和伤害性信号传导加剧疼痛。
3 讨论
本研究首次揭示CRISPLD2在IVDD中通过miR-548I-IL17A轴抑制铁死亡的新机制。CRISPLD2在退变早期代偿性上调，晚期下调，其缺失导致IL17A介导的氧化应激和铁死亡，破坏ECM稳态并引发疼痛。靶向该轴（如AAV-CRISPLD2或miR-548I模拟物）可能成为IVDD的潜在治疗策略。
4 结论
CRISPLD2通过miR-548I-IL17A轴抑制氧化应激诱导的铁死亡，维护髓核细胞稳态，延缓IVDD进展，并调控疼痛敏感性，为IVDD的治疗提供了新靶点。
5 实验方法
研究包含人类椎间盘组织采集、髓核细胞分离培养、Western blot、RT-qPCR、免疫荧光、动物模型构建（LSI、CINS）、行为学测试、病毒注射（AAV）、转录组/脂质组学分析等实验，数据以均值±标准差表示，统计学处理采用t检验或单因素方差分析。
