《Environmental Microbiology Reports》：Systemic Activation of the Antioxidant System by Root Priming With Non-Pathogenic Fusarium oxysporum in Flax Infected With Pathogenic Fusarium oxysporum
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本研究揭示了非致病性尖孢镰刀菌（Fo47）通过根系预激活（priming）机制，系统性地增强亚麻对致病性尖孢镰刀菌（Foln）抗性的新策略。研究证实，Fo47定殖可局部抑制根部病原菌侵染，并系统激活地上部抗氧化防御体系（包括SOD、CAT、APX等酶活及酚类物质），显著降低病害指数，为可持续植物保护提供了理论依据。
引言
在自然环境中，植物必须不断防御生物和非生物胁迫，包括病原体入侵。尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是最重要的植物病原体之一，对全球经济和食品安全有直接影响。该土壤传播的无性真菌包括致病性和非致病性菌株。由致病性菌株引起的典型症状包括发育不良、萎蔫、褪绿、坏死和维管束损伤。亚麻尖孢镰刀菌（Foln）是攻击亚麻作物的主要病原体之一，引起亚麻枯萎病，导致产量和纤维质量显著下降。根系被内生非致病性尖孢镰刀菌菌株定殖可以减轻由致病性菌株引起的疾病症状。非致病性Fo47菌株是首批被证明可降低镰刀菌枯萎病风险的内生菌之一。内生Fo47可减少番茄、芦笋、鹰嘴豆和棉花等多种作物中的镰刀菌枯萎病。在亚麻中也观察到类似结果。然而，内生菌介导的抗镰刀菌抗性是如何实现的尚不清楚，文献描述根据不同宿主存在不同机制。在胁迫条件下，植物细胞能够产生大量活性氧（ROS），主要包括H2O2。研究表明，致病性和非致病性尖孢镰刀菌菌株在定殖亚麻过程中都可能触发瞬时的H2O2产生。植物细胞产生ROS，如过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O2•?）、羟基自由基（•OH），作为其正常代谢的副产物。ROS既可以作为有毒分子对抗病原体，也可以作为防御反应中重要的信号分子。由ROS引起的细胞死亡可能导致宿主细胞坏死，从而限制感染的发育。植物对病原体攻击的早期防御反应称为氧化爆发，产生局部和瞬时的ROS。除了对病原体存在的直接反应外，ROS还参与与防御基因表达诱导相关的细胞信号传导。ROS产生的双相性：第一阶段通常发生在病原体攻击后几分钟内，是短暂且微弱的，而第二阶段则强烈且持久。然而，ROS的积累必须受到抗氧化系统的控制以避免过度毒性。抗氧化酶如抗坏血酸过氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、NADPH氧化酶（NADPHox）和过氧化氢酶（CAT）的活性在这些过程中起着重要作用。清除H2O2的主要系统之一是抗坏血酸-谷胱甘肽循环。在该途径中，APX使用抗坏血酸作为专用电子供体将H2O2还原为水。在高等植物中，不同的APX同工酶存在于各种亚细胞位置，如叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和细胞质中，允许在细胞器和整个细胞水平上精细控制H2O2浓度。APX也可能作为H2O2信号调节剂。SOD是一种促进超氧自由基歧化为分子氧（O2）和过氧化氢的酶。作为金属酶，SOD依靠结合的金属离子进行这种转化。在植物细胞中，Cu/Zn SOD通常存在于细胞质、叶绿体，有时在质外体中；Fe SOD位于叶绿体内，而Mn SOD主要存在于线粒体基质和过氧化物酶体中。SOD是抗氧化损伤的主要防御手段，对于调节非生物和生物胁迫条件下产生的ROS至关重要。胁迫下观察到SOD转录本丰度增加。植物免疫包含病原体识别的层级，其中NADPH氧化酶是ROS的核心发生器，启动并塑造防御信号，从而影响多种植物系统的抗性。它们是催化电子从NADPH转移到O2从而产生O2•?的关键酶。过氧化氢酶是一种由四个相同亚基组成的含铁蛋白。该酶广泛存在于过氧化物酶体中，将过氧化氢转化为水和氧气。与SOD和氢过氧化物酶一起，过氧化氢酶构成消除超氧自由基的抗氧化防御系统的一部分。在大多数情况下，CAT（由于其高KM）去除了大部分转运到过氧化物酶体的H2O2，而像APX这样具有较低KM因而对H2O2有更高亲和力并分布于各种亚细胞区室的酶，则精确调节这种活性分子的水平。它被认为是主要的抗氧化酶之一，在发育和胁迫响应中起着至关重要的作用。此外，植物拥有由天然抗氧化分子组成的非酶促防御系统。这些包括水溶性物质，如抗坏血酸、谷胱甘肽、酚类化合物和类黄酮，以及脂溶性代谢物，如类胡萝卜素和α-生育酚。这些抗氧化剂通过提供电子中和ROS，将其转化为危害较小的形式，而在此反应中产生的氧化副产物保持相对稳定和无毒。由ROS水平变化或抗氧化系统效率改变引起的氧化还原稳态紊乱可能在植物组织对病原体的防御反应中起关键作用；因此，在这项工作中，我们想研究这种机制是否在通过非致病性尖孢镰刀菌菌株获得的亚麻对枯萎病的抗性中也起作用。
材料与方法
亚麻种子（Linum usitatissimumL., cv. Nike）来自波兰天然纤维和药用植物研究所的亚麻和大麻收集库。种子灭菌后播种在补充有Murashige和Skoog培养基（MS培养基）的蛭石上。幼苗在受控环境的植物生长室中生长14天，然后用于实验。使用的真菌菌株是非致病性尖孢镰刀菌（Fo47）和致病性尖孢镰刀菌f. sp. lini(Foln)，在PDA培养基上28°C培养。孢子悬液稀释至106spores/ml用于接种。
建立了两种体外研究模型。模型1：两周龄亚麻植株用0.5 mL非致病性菌株（106spores/ml）处理，4天后用相同浓度的致病性菌株处理。模型2：两周龄亚麻植株同时用0.5 mL非致病性和致病性菌株（均为106spores/ml）处理。设置了适当的对照。在模型1中，在以下时间点收集样本：处理Fo47后2天（2 dptN）、处理Fo47后4天/处理Foln前（4 dptN/0 dptP）、处理Fo47后6天/处理Foln后2天（6 dptN/2 dptP）、8 dptN/4 dptP、10 dptN/6 dptP和8 dptN/14 dptP。在模型2中，在处理Foln和Fo47菌株后2、4、6和14天（dptP/N）收集样本。所有收获的材料立即在液氮中冷冻并储存在-80°C直至分析。实验进行了三次生物学重复。
通过显微镜观察评估真菌菌丝在亚麻根组织中的进展，并建立了5点评分标准。根据症状严重程度计算病害指数（DI）。使用CTAB法分离植物和真菌DNA。通过特异性PCR和qPCR鉴定和定量真菌DNA，特别是针对Fo47和Foln的特异性片段以及murein transglycosylase基因和致病菌的six7基因。使用TRIzol试剂或商业试剂盒分离总RNA。通过qPCR分析PR基因（几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶）和抗氧化系统相关基因（NADPH oxidase D, F, C、SOD Cu/Zn, Mn, Fe、catalase、ascorbate peroxidase）的mRNA水平。使用商业试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。使用Amplex Red试剂盒测定过氧化氢（H2O2）含量。通过DPPH法测定抗氧化潜力。通过NBT染色和提取物吸光度测定超氧阴离子（O2•–）含量。使用UPLC分析酚类化合物（香草醛、反式阿魏酸、对香豆酸）的含量。所有数据均以三次重复的平均值±标准差表示，使用Statistica 13软件进行单因素方差分析和Fisher事后检验，p< 0.05认为有统计学意义。
结果
表型观察显示，用非致病性菌株处理的植物没有显示出显著的表型变化。在用致病性菌株处理的植物中，接种后28天，植物变黄或变褐，叶片卷曲，茎开始弯曲，并且在蛭石表面和植物表面观察到菌丝体生长。42天后，这些症状加剧。预激活的植物在处理后28和42天出现感染迹象，但不如仅用致病性菌株处理的植物广泛。同时用非致病性和致病性菌株处理的植物变得弯曲，叶片开始卷曲并变为黄褐色，并且在其表面也注意到菌丝生长。然而，这些变化比仅用Foln菌株处理的植物轻，但比预激活的植物更严重。病害指数分析证实了植物组间的显著差异。
真菌菌丝可视化显示，在未处理的植物根组织中没有观察到真菌菌丝。在仅用非致病性菌株Fo47处理的植物中，首次在4 dptP（8 dptN）观察到少量真菌菌丝。在6和14 dptP（10和18 dptN），菌丝数量显著增加。在仅用致病性菌株Foln处理的植物中，在4 dptP检测到单个菌丝。在6 dptP，观察到菌丝数量快速增加，在大多数分析的横切面中存在大量菌丝。到14 dptP，在大多数检查的样品中可见非常高密度的菌丝。在预激活的植物中，在4 dptP观察到单个菌丝。到6 dptP，菌丝密度显著增加，在许多分析的横切面中达到高水平。然而，到14 dptP，菌丝数量没有进一步增加，并保持在与6 dptP观察到的相当的水平。在同时用Fo47和Foln处理的植物中，在6 dptP检测到单个真菌菌丝。到14 dptP，菌丝数量增加，并在大多数分析的横切面中可见。
通过PCR和qPCR确认了致病性和非致病性尖孢镰刀菌菌株在亚麻植物中的存在。在预激活植物的根中，与仅用致病性菌株处理的植物相比，Foln的丰度显著降低。同时接种两种真菌菌株也导致Foln水平降低，但高于预激活植物。预激活植物的地上部Foln丰度也较低。qPCR分析murein transglycosylase基因显示，随着时间推移，亚麻根和地上部真菌DNA含量增加，证实两种菌株在植物组织中繁殖。在预激活植物和同时用两种菌株处理的植物的根中，该基因的数量随时间增加，在第14天比在2 dptP用Foln处理的根中的真菌DNA量高出500倍以上。致病菌特异性six7基因拷贝数分析表明，预激活植物根中的拷贝数低于仅用致病性菌株处理的植物。同时接种的植物根中也观察到拷贝数减少。
PR基因和抗氧化酶基因的转录水平分析显示，用Fo47和Foln单独处理的植物中，几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的mRNA水平随时间增加，但用Foln处理的植物从4 dptP开始表现出比用Fo47或同时接种两种菌株的植物更高的转录水平。在预激活植物的根中，几丁质酶基因的mRNA水平在4、6和14 dptP显著增加，但在6和14 dptP与Foln处理的植物相比降低。抗氧化相关基因（NADPH oxidase D, F, C、SOD Cu/Zn, Mn, Fe、catalase、ascorbate peroxidase）的转录水平显示出复杂的时间动态变化。在预激活植物的根和地上部，许多基因的转录本在早期时间点（如2 dptP）被诱导。同时接种的植物也显示出转录水平的变化，但模式不同。
SOD和CAT活性测定显示，最显著的变化发生在预激活植物的根中，而地上部没有检测到变化。在预激活植物的根中，与仅用Foln处理的植物相比，在2 dptP时根SOD活性增加1.8倍，而在4、6和14 dptP分别降低27%、34%和49%。在同时用两种菌株处理的植物组中，仅在用Foln处理的植物的根中在14 dptP观察到SOD活性增加1.6倍。在预激活植物组中，根中的过氧化氢酶活性仅在用Fo47处理的植物在2 dptP增加2.3倍。在地上部，在2 dptP，预激活植物的CAT活性与未处理植物相比增加2.65倍，与Foln处理的地上部相比增加2倍。
H2O2和O2•–含量分析显示，在预激活植物和Foln处理植物的根中，H2O2含量在14 dptP高2.3倍。在预激活植物的根中，与未处理植物相比，O2•–含量在2和14 dptP分别低33%和52%，而与Foln处理的植物相比，在2、4、6和14 dptP分别高1.5、1.9、2.4和3.6倍。
酚类化合物含量分析表明，在预激活并用Foln处理的植物的根中，在6 dptP观察到阿魏酸含量增加1.7倍，在4 dptP对香豆酸含量降低32%。在地上部，预激活并用Foln处理的植物在4 dptP香草醛含量增加2.5倍。抗氧化潜力测定显示，含有游离酚类化合物的提取物的抗氧化潜力在预激活植物和处理同时用两种菌株的植物的根和地上部在不同时间点升高。
讨论
植物在其自然环境中必须激活专门的适应机制以增强对胁迫因素的抗性。其中一种机制是预激活，短期暴露于轻度胁迫会触发防御机制的激活，从而能够对后续胁迫做出更快、更强的反应。在准备植物防御的各种因素中，非致病性微生物菌株可以通过作用于种子或植物来增强植物免疫力。
本研究的目的在于确认非致病性菌株尖孢镰刀菌Fo47通过根系定殖作为预激活剂，显著限制由致病性菌株尖孢镰刀菌Foln引起的亚麻病害发展。此外，我们旨在确定Fo47是否通过激活抗氧化系统来诱导抗性。
进行了两种独立的植物处理。在第一种处理中，为了评估尖孢镰刀菌Fo47是否作为预激活剂，亚麻植株先用Fo47处理，4天后添加致病性菌株Foln。在第二种处理中，为了确认这种效果，亚麻植株同时接种两种菌株（非预激活植物）。受感染植物的表型分析以及计算的病害指数显示，非致病性尖孢镰刀菌显著抑制了亚麻枯萎病的进展。值得注意的是，在预激活植物中，疾病症状抑制明显大于Fo47与Foln同时引入基质的植物。这些发现表明，Fo47作为预激活剂，显著增强亚麻对枯萎病的抗性，同时在与Foln共同施用时可发挥中等抑制效果。
为了阐明非致病性Fo47的预激活机制，我们定量了致病性和非致病性尖孢镰刀菌菌株的水平，分析了PR基因和抗氧化系统相关基因的转录水平，测量了过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，并评估了预激活植物和同时用两种菌株处理的植物中的过氧化氢和超氧阴离子水平、酚类化合物含量和抗氧化潜力。
显微镜分析显示，单个Foln菌丝早在4 dptP就出现在根中，而Fo47菌丝仅在8 dptN可检测到。此外，在14 dptP，观察到致病性尖孢镰刀菌的存在显著高于非致病性Fo47。这表明Foln的穿透速率更快，根定殖更广泛。针对Fo47和Foln特异性DNA片段的PCR分析以及murein transglycosylase的相对表达表明，两种菌株早在4 dptP/N就存在于亚麻根中。尽管如此，Fo47在根中的丰度低于Foln，进一步支持Foln更快地渗透植物组织。此外，Foln表现出更快的定殖速率，这体现在用Foln处理的植物根和地上部在6和14 dptP的murein transglycosylase水平高于用Fo47处理的植物。
除了真菌生物量的差异外，尖孢镰刀菌病原体和内生菌株的根定殖模式也不同。我们的结果表明两种菌株都存在于亚麻地上部，这与文献数据不同，文献表明致病性菌株通常具有入侵木质部导管的能力，从而实现地上部组织的系统定殖，而Fo47在豌豆中的定殖限于根表面和最外层皮质细胞层；致病性尖孢镰刀菌f. sp. pisi积极穿透更深的根组织，包括维管系统。类似地，在番茄中，Fo47和尖孢镰刀菌f. sp. lycopersici最初都定殖根表面，随后向伸长区和根尖进展。然而，只有致病性菌株广泛入侵更深的根组织并最终到达维管系统，而Fo47仅限于表皮和皮层。重要的是，根组织的穿透可以通过激活活周维细胞中的抗氧化系统来限制，限制其中的氧化损伤，从而防止感染向木质部扩散。相反，有报道称Fo47定殖桉树的木质部导管，而内生菌株Fo CS-20在黄瓜的木质部中被检测到。Fo47的菌丝也在拟南芥和番茄根的维管系统中观察到，尽管它们的存在限于侧根的维管系统和初生根伸长区。相反，只有致病性菌株成功定殖初生成熟区上方的木质部。广泛的根皮层和维管系统定殖是致病性菌株的标志，这种能力与细胞壁降解酶分泌增加有关。
植物预激活是通过首先将尖孢镰刀菌Fo47孢子引入基质，4天后添加尖孢镰刀菌Foln孢子进行的。在Foln接种时，Fo47菌丝已经存在于植物根中，这减少了Foln的穿透和定殖。在预激活植物的根和地上部，Foln丰度显著低于仅用Foln处理的植物。有趣的是，同时接种两种真菌菌株也导致Foln水平相对于仅用Foln处理的植物降低。然而，Foln丰度仍然高于预激活植物。这表明竞争性宿主定殖，在预激活植物中，Fo47的较早建立可能限制了Foln的入侵。根表面空间或营养的竞争也被假设是非致病性尖孢镰刀菌菌株F2对抗茄子中大丽轮枝菌的主要作用机制，因为发现施用F2降低了植物中大丽轮枝菌的DNA水平。
在预激活植物中，Fo47在根中局部抑制Foln定殖92%，而在系统上将其在地上部的存在减少87%。此外，当植物同时用两种菌株处理时，Fo47在局部将Foln定殖减少50%，但不抑制其系统传播。
在用Fo47和Foln单独处理的植物中，几丁质酶的mRNA水平随时间增加，从2 dptN/P开始。然而，从4 dptN/P开始，用Foln处理的植物表现出比用Fo47或同时接种两种菌株的植物更高的转录水平。这些结果与接种强毒尖孢镰刀菌f. sp. lycopersici和生防菌株尖孢镰刀菌Fo47的番茄植物的转录组学研究一致，其中两种几丁质酶同工型和两种β-葡聚糖酶同工型的mRNA水平在最初几小时较低，但在随后几小时，感染致病性菌株的植物中显著高于用非致病性菌株处理的植物。这表明在预激活植物中，在Foln接种时，几丁质酶转录水平已经显著高于对照植物。这些差异在2 dptP和4 dptP尤其明显，而从6 dptP开始，几丁质酶转录水平在用Foln处理的植物中变得显著高于预激活植物。总之，Fo47的预激活效果在2至4 dptP之间最为明显。对于β-葡聚糖酶转录本也观察到与几丁质酶相似的趋势。文献数据也证明了用Fo47预激活植物的类似关系。
ROS分析表明，H2O2的初始增加发生在Foln处理植物约2 dptP和Fo47处理植物约6 dptN，随后在任一种处理约14天后出现第二次增加。类似的早期H2O2波动在亚麻细胞悬浮液中有报道，其中Foln3和Fo47在相互作用的最初几分钟内都触发了瞬时的H2O2产生，但非致病性菌株也在接种后3小时诱导了第二次氧化爆发，导致Fo47处理中死细胞数量更多。有趣的是，在预激活植物中，在根中在2和14 dptP检测到两个H2O2峰，类似于Foln处理的根。这种模式表明典型的两相氧化爆发，其中第一个峰可能作为信号或预激活事件，准备细胞进行防御，然而需要进一步研究。第二个更强的峰可能对应于通过细胞器如线粒体和叶绿体中ROS产生加强诱导的细胞死亡。在花生中证实了早期H2O2积累的类似模式，其中B3预接种植物的地上部和根在Fo感染时表现出H2O2产生增加，类似于仅用Fo处理的植物。在水稻中，在2 dptP也检测到H2O2增加，尽管在B3预接种植物的根和地上部中显著低于共同接种（B3 + F. proliferatum）或F. proliferatum处理的植物。在鹰嘴豆中观察到类似趋势，其中单独用尖孢镰刀菌f. sp. ciceris(Foc)处理导致H2O2含量增加高于预先用Streptomyces araujoniae(TN)预激活的植物。在这些植物中，尽管与未处理植物相比SOD活性显著增加，但在Foc处理和Foc + TN处理的植物之间未观察到SOD和CAT活性的显著差异。在茄子中也报道了SOD活性增加，在感染Alternaria solani前用Aspergillus terreus预激活的植物中效果比仅用病原体处理的植物更明显。然而，感染和预激活植物之间的CAT活性相当。在感染尖孢镰刀菌f. sp. lycopersici的番茄中，抗氧化系统（酚类化合物含量增加、H2O2浓度增加、以及抗氧化酶SOD、CAT、GPX和APX活性增加）的初始激活随时间减弱（特别是CAT活性降低），表明抗氧化系统不够强以阻碍病原体向宿主的穿透和传播。然而，我们的研究表明，用Fo47处理亚麻会诱导这些植物中的抗氧化系统，在感染致病性Foln后，比仅感染Foln的植物更快、更有效地发挥作用，不仅是局部地而且是系统地。
Fo47处理植物根中H2O2水平的增加与6和14 dptN时过氧化氢酶活性升高以及18 dptN时超氧化物歧化酶活性增加相关。6 dptN时H2O2的上升可能源于4 dptN时NADPH oxidase D转录本的上调，而随后在8 dptN时NADPHox F、NADPHox C、sodMn和sodFe转录本的增加，以及10 dptN时catmRNA水平的降低，支持在这些时间点维持ROS稳态。此外，14 dptN时NADPHox C的上调和cat的下调，随后18 dptN时sodCu和apxmRNA水平的增加，可能有助于抵消氧化应激和平衡H2O2水平。在Fo47处理植物的地上部，未观察到抗氧化酶活性的显著变化。然而，检测到这些基因转录水平的变化。早在2 dptN就明显出现NADPHox F转录本显著下降。从8到18 dptN，观察到NADPHox D转录本水平增加，同时sod和apx转录本水平先下降后上升。
在Fo47处理植物根中观察到的相关性在Foln处理的根中不存在，后者仅在4和14 dptP时SOD活性增加。ROS代谢相关基因的转录本分析揭示了时间波动，在14 dptP时所有分析转录本显著上调。在Foln处理植物的地上部，未检测到抗氧化酶活性的显著变化。然而，观察到转录水平的变化，包括
