《Cell Death Discovery》：Unveiling the toxic effects of perfluorooctanoic acid on osteoblast function and extracellular matrix deposition using 2D and 3D models
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本研究针对全氟辛酸（PFOA）暴露与骨质疏松风险增加的相关性，利用2D（增殖期）和3D（分化期）人胎儿成骨细胞（hFOB1.19）模型，系统探讨了PFOA对成骨功能的毒性作用。研究发现，PFOA暴露呈现非单调的剂量和时间依赖性效应：在2D模型中主要损害抗氧化防御（CAT、NRF2下调）而不直接影响钙沉积；在3D类器官中则破坏形态结构，并差异化调节胶原（COL1A2）降解和大麻素受体1（CB1）水平。该研究为理解PFOA破坏骨稳态的复杂机制提供了新视角，强调了利用3D模型评估环境污染物骨毒性的重要性。
骨骼，这个支撑我们身体的精密结构，正悄然面临着一类新型环境污染物的威胁——全氟和多氟烷基物质（PFAS）。其中，全氟辛酸（PFOA）因其在环境和人体中的高度持久性而备受关注。越来越多的证据表明，PFOA暴露与骨密度降低和骨质疏松风险增加存在关联，这提示骨骼是PFAS的一个重要靶器官。骨质疏松作为一种常见的代谢性骨病，严重影响全球数亿人的健康，尤其困扰着老年和绝经后女性群体，给社会带来巨大的医疗和经济负担。然而，PFOA究竟在成骨细胞（负责骨基质分泌的细胞）生命周期的哪个阶段（增殖期还是分化期）造成最显著的损害，其具体分子机制又如何，目前仍不明确。
为了解决这一关键科学问题，由Fiorenza Sella和Caterina Licini共同领导的研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新研究成果。他们创新性地采用2D和3D两种人胎儿成骨细胞（hFOB1.19）培养模型，分别模拟成骨细胞的增殖期和分化期，深入探究了不同浓度PFOA暴露的毒性效应。研究的主要假设是PFOA可能通过干扰氧化应激防御、胶原降解以及内源性大麻素系统（ECS）中的大麻素受体1（CB1），差异化地影响不同生理阶段的成骨细胞稳态和细胞外基质（ECM）沉积。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键技术方法。研究核心是使用了hFOB1.19人胎儿成骨细胞系。他们分别建立了2D单层培养模型（用于研究增殖期）和通过悬滴法形成的3D骨细胞球体模型（用于研究分化期）。细胞活性分别通过MTT法（2D）和钙黄绿素/碘化丙啶（Calcein/PI）活死染色（3D）进行评估。通过显微镜成像和ImageJ软件分析对3D球体的形态学参数（如面积、圆形度、坚实度）进行量化。细胞外基质钙沉积通过阿尔新红染色（Alizarin red staining）进行检测。蛋白质表达水平，包括碱性磷酸酶（ALP）、Runt相关转录因子2（RUNX2）、过氧化氢酶（CAT）、核因子E2相关因子2（NRF2）、I型胶原α2链（COL1A2）及其降解形式、CB1受体等，均通过蛋白质印迹法（Western Blotting）进行分析。此外，还采用了免疫细胞化学和全贴片免疫荧光技术对组蛋白修饰（H3K9ac, H4K12ac）和CB1的定位进行观察。
Effects of PFOA on the cell viability of 2D and 3D hFOB1.19 culture
研究人员首先评估了PFOA对细胞活性的影响。在2D培养模型中，MTT实验显示，50μM和100μM的PFOA会显著降低细胞活性，因此后续实验采用0.1, 1, 10μM这三个浓度。在3D球体模型中，活死染色显示，暴露2天后，0.1和1μM PFOA即可引起活性轻微但显著的下降，而10μM, 100μM和1mM浓度则导致活性急剧降低。暴露5天后，所有浓度的PFOA均显著降低细胞活性，其中1mM被确定为半数致死剂量（DL50）并被排除在后续实验之外。这些结果一致表明PFOA对成骨细胞具有剂量依赖性的细胞毒性。
Impact of PFOA on 3D hFOB1.19 morphology
PFOA对3D成骨细胞球体的形态产生了显著影响。暴露2天后，所有浓度的PFOA均显著降低了球体的圆形度（Circularity）和坚实度（Solidity），并且0.1至100μM的PFOA还增大了球体的面积。暴露5天后，0.1和100μM PFOA处理组依然表现出面积增大、圆形度和坚实度下降；而1和10μM处理组则表现为圆形度和坚实度的显著降低，但面积无显著变化。这些形态学改变表明PFOA破坏了骨球体的正常结构发育。
The effects of PFOA on calcium deposition during bone cell proliferation and differentiation
阿尔新红染色结果显示，在2D培养（增殖期）中，PFOA暴露并未引起钙结节沉积的显著变化。在3D球体（分化期）中，暴露2天的PFOA处理也未影响钙化。然而，当暴露时间延长至5天时，0.1μM的低浓度PFOA反而显示出降低矿化百分比的趋势（p=0.052），而100μM的高浓度处理则表现出矿化增加的迹象，呈现出非单调的剂量效应关系。这表明PFOA在成骨细胞分化期对钙沉积的影响具有时间和剂量特异性，低剂量长期暴露可能损害矿化过程。
The effects of PFOA exposure on osteogenesis during the proliferation phase
在2D增殖期模型中，PFOA暴露并未显著改变成骨分化关键标志物的水平。碱性磷酸酶（ALP）的蛋白水平和ALP阳性区域面积均无显著变化。调控成骨分化的关键转录因子RUNX2的蛋白水平也未受PFOA影响。此外，与基因转录激活相关的组蛋白修饰（H3K9ac和H4K12ac）的乙酰化水平在PFOA暴露后也保持不变。这些结果表明，在增殖期，PFOA并未直接干扰成骨分化标志物的表达或相关的表观遗传修饰。
The effects of PFOA exposure on bone oxidative stress
氧化应激是PFOA毒性的一个重要机制。在2D模型中，所有测试浓度的PFOA均显著降低了过氧化氢酶（CAT）的蛋白水平。同时，1和10μM PFOA也下调了核因子E2相关因子2（NRF2）的蛋白表达。在3D球体中，暴露2天后，100μM PFOA引起CAT水平轻微下降（p=0.07），此下降在暴露5天后变得显著。与此相反，暴露5天后，100μM PFOA处理组的NRF2水平却显著升高。这些发现表明PFOA破坏了骨的氧化平衡：在增殖期（2D）它削弱了抗氧化防御能力（CAT和NRF2均下调）；而在分化期（3D），高浓度PFOA初期引起CAT下降，但长期暴露可能触发了NRF2介导的代偿性保护反应。
Effects of PFOA on bone extracellular matrix
研究人员进一步探究了PFOA对细胞外基质关键成分I型胶原α2链（COL1A2）及其潜在调控因子CB1受体的影响。在2D培养中，10μM PFOA显著降低了COL1A2和CB1的蛋白水平。在3D球体中，情况更为复杂：暴露2天后，100μM PFOA显著增加了CB1的水平，同时伴随着降解形态的COL1A2（60 kDa）水平的降低（p=0.07）。暴露5天后，100μM PFOA组的CB1水平恢复至对照组水平，降解胶原水平也无显著变化；而0.1μM PFOA则显著增加了降解胶原的水平，但与CB1变化无关。免疫荧光染色证实了CB1受体在成骨细胞膜上的定位。这些结果提示，PFOA可能主要通过胶原相关通路影响ECM，而CB1可能在此过程中，特别是在分化早期，扮演了某种角色，但其精确机制有待阐明。
综上所述，本研究揭示了PFOA对成骨细胞功能和细胞外基质沉积产生相依赖性和时间依赖性的非单调效应。在模拟增殖的2D模型中，PFOA主要损害抗氧化防御体系（CAT、NRF2下调），但不直接影响成骨分化标志物和钙沉积。在模拟分化的3D球体模型中，PFOA则破坏了球体的正常形态结构，并以复杂的剂量和时间模式影响钙沉积、CB1受体水平和胶原降解。特别值得注意的是，低浓度（0.1-1μM）PFOA主要通过损害矿化和改变蛋白表达来破坏骨稳态，而高浓度（10-100μM）则表现出更强的细胞毒性并损害抗氧化防御。这些发现强调了在评估环境污染物骨毒性时，需要结合2D和3D模型，并考虑不同暴露剂量和时间的综合影响。该研究为理解PFOA破坏骨稳态的复杂机制提供了新的实验证据，突出了内源性大麻素系统（特别是CB1受体）和氧化应激通路在PFOA骨毒性中的潜在作用，为未来探索相关的干预策略指明了方向。
