人源呼吸体中线粒体复合物IV晚期成熟的结构基础揭示HIGD2A-NDUFA4置换组装机制

《Nature Communications》：Structural basis for late maturation steps of mitochondrial respiratory chain complex IV within the human respirasome

本研究针对线粒体呼吸链超级复合物（respirasome）组装机制这一关键科学问题，通过冷冻电镜技术解析了人源CI+CIII2+CIV呼吸体高分辨率结构，首次捕获了复合物IV（CIV）在其内部的晚期组装中间态。研究发现HIGD2A作为分子占位符与CIV结合，并在最终成熟步骤中被NDUFA4取代，从而阐明了呼吸体生物发生的有序时空调控机制，为线粒体疾病（如Leigh综合征）的致病机理提供了新的结构见解。

　　

在真核细胞的能量工厂——线粒体中，一套精密的“发电系统”负责着细胞能量的转换。这就是位于线粒体内膜上的氧化磷酸化系统，它由四个复杂的蛋白质机器（复合物I到IV，简称CI-CIV）和两个移动的电子载体构成。它们协同工作，将营养物质中的化学能转化为细胞通用能量货币ATP。更为奇妙的是，这些复合物并非总是独立工作，它们能够进一步组装成更高级的超级复合物，其中最为典型的是包含CI、CIII二聚体（CIII₂）和CIV的“呼吸体”，它能够高效地完成从NADH到氧气的完整电子传递链反应。

然而，如此复杂的超级复合物是如何被准确组装起来的，一直是领域内的核心谜题。特别是，它们是像拼装乐高积木一样，由预先完全组装好的单个复合物拼接而成？还是说，在组装过程中，部分尚未完工的复合物中间体就会提前“找好队友”，在超级复合物的框架内完成最后的“精装修”？这个问题不仅关乎我们对生命基本过程的理解，更与人类健康息息相关，因为线粒体呼吸链的组装缺陷会导致一系列严重的遗传性疾病，如Leigh综合征等脑肌病。

为了解开呼吸体组装之谜，特别是搞清复合物IV（CIV，又称细胞色素c氧化酶）这一关键部件是如何在呼吸体背景下完成其最后组装步骤的，由Minh Duc Nguyen和Ana Sierra-Magro作为共同第一作者，Antoni Barrientos和Joanna Rorbach作为共同通讯作者领导的研究团队，在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们利用冷冻电镜这一强大的结构生物学工具，成功解析了从人胚胎肾细胞（HEK293）中分离出的天然CI+CIII₂+CIV呼吸体的高分辨率结构，并意外地捕捉到了CIV在呼吸体内的晚期组装中间状态。

研究人员主要通过以下几种关键技术方法开展研究：利用基因工程技术构建了带有FLAG标签的COX14（一种CIV生物发生因子）的HEK293细胞系，用于后续的蛋白质复合物纯化；采用差速离心法从大规模培养的细胞中分离高纯度的线粒体；使用去垢剂LMNG温和地溶解线粒体膜，并通过免疫亲和层析技术特异性富集含有COX14-FLAG的蛋白质复合物；利用单颗粒冷冻电镜技术解析呼吸体及其组成复合物的高分辨率三维结构，并通过三维变异性分析和局部重构等技术深入解析结构的异质性；构建HIGD2A和NDUFA4的基因敲除（KO）细胞系以及利用患者来源的线粒体DNA突变细胞系（143B cybrids），通过蓝绿温和胶电泳（BN-PAGE）、免疫共沉淀、免疫印迹、光谱法酶活测定和极谱法细胞呼吸测量等生物化学和细胞生物学方法，验证结构发现并探究其功能意义。

结果

人源呼吸体结构的解析

研究人员通过冷冻电镜获得了整体分辨率为3.1 ?的CI+CIII₂+CIV呼吸体结构。进一步的局部重构将CI、CIII₂和CIV的分辨率分别提升至2.9 ?、2.77 ?和3.1 ?。分析发现，CIV部分的密度相对较弱且更具柔性，暗示了其存在结构异质性。

人源复合物I在2.7 ?分辨率下的结构

对CI的聚焦重构得到了2.66 ?分辨率的结构，显示其处于“活性静息态”。该高分辨率模型允许研究人员精确构建了14个常见磷脂分子，并观察到了NDUFS2亚基的精氨酸甲基化和NDUFS7亚基的丝氨酸磷酸化等新的翻译后修饰。

人源复合物III在2.5 ?分辨率下的结构

这是目前分辨率最高的人源CIII结构（2.5 ?）。该结构清晰地展示了血红素b_H、b_L、c₁以及泛醌（UQ）结合位点，但由于构象异质性，未能观察到Rieske铁硫蛋白（RISP）中的铁硫簇清晰密度。

HIGD2A和NDUF4A结合的复合物IV中间体结构

对CIV的深入分析揭示了关键发现。通过三维分类，研究人员识别出四种不同的CIV状态，清晰地展示了HIGD2A和NDUFA4在CIV上一个部分重叠的结合位点上的动态交替过程。其中一类结构显示HIGD2A结合在由COX1、COX3和COX6A1形成的裂隙中；另一类则显示NDUFA4占据了该位置；还有两类中间状态则同时显示出HIGD2A的密度和即将结合的或已部分结合的NDUFA4密度。免疫共沉淀实验证实，HIGD2A和NDUFA4确实都能与呼吸体形式的CIV发生相互作用，并且有少量二者共存于同一颗粒中，支持了冷冻电镜观察到的中间态。

HIGD2A结合的复合物IV的结构特征

在HIGD2A结合的状态下（分辨率2.93 ?），研究人员解析了HIGD2A的结构，其C端结构域与COX3通过保守的QRRQ基序（特别是Arg80, Arg82, Gln86）与COX3上的His149, Asp246, His250发生特异性相互作用。HIGD2A通过疏水和范德华力与COX3及COX6A1相互作用。结构中还观察到一个心磷脂（CDL）分子对维持复合物结构完整性可能起重要作用。

NDUFA4结合的复合物IV的结构

在NDUFA4结合的状态下（分辨率3.2 ?），NDUFA4的一个跨膜螺旋与COX1和COX2的跨膜螺旋平行，其结合稳定了上述心磷脂分子。功能实验表明，敲除NDUFA4会导致CIV酶活性和细胞的内源性呼吸速率下降约50%。对线粒体疾病患者来源的细胞系（COX1, COX2, COX3突变）的分析显示，NDUFA4只出现在完全组装的CIV中，而不存在于任何CIV亚组装体中，证实了NDUFA4是在CIV组装最后阶段被整合的。

HIGD2A和NDUFA4向CIV的层级式整合

生化实验有力地支持了结构观察到的置换模型。在HIGD2A敲除细胞中，NDUFA4的水平与其他CIV亚基同步下降。相反，在NDUFA4敲除细胞中，HIGD2A从原本富集的50-kDa调控复合体中重新分布，更多地积聚在完全组装的游离CIV和呼吸体形式的CIV中，定量分析显示积累增加了2-3倍。在野生型细胞中，过表达HIGD2A会减少NDUFA4与CIV的结合，反之亦然。在HIGD2A敲除细胞中，过表达NDUFA4能部分挽救CIV的组装和活性；而在NDUFA4敲除细胞中过表达HIGD2A则对细胞有害。这些数据共同支持了一个模型：HIGD2A作为占位因子，在CIV组装早期协助COX3模块整合后，暂时停留在其结合位点上，防止NDUFA4过早结合；随后，NDUFA4整合进来，置换出HIGD2A，从而完成CIV以及整个呼吸体的最终成熟。

结论与讨论

这项研究通过高分辨率结构生物学和系统的生化分析，揭示了人源呼吸体CI+CIII₂+CIV生物发生的最终步骤，特别是阐明了CIV在其内部的晚期组装机制。研究首次在结构上捕获了HIGD2A作为分子占位符与呼吸体中的CIV结合，并最终被结构性亚基NDUFA4所取代的动态过程。这一发现完善了呼吸体协作组装的模型，表明呼吸体的组装并非简单地拼接成熟复合物，而是可以作为一个平台，促进其成员复合物（尤其是CIV）的最终成熟。

该研究具有重要的生理和病理意义。首先，它为理解由NDUFA4突变引起的线粒体疾病（如Leigh综合征）提供了分子病理机制：NDUFA4的缺失并非完全破坏呼吸体组装，而是阻碍了CIV的功能性成熟，导致其活性显著降低，进而影响整体能量代谢。其次，研究提出了HIGD2A作为“分子计时器”的新功能，它不仅确保组装过程的有序进行，还可能为细胞在应激条件下的快速适应提供了可能。NDUFA4存在组织特异性或条件特异性异构体（如缺氧诱导的NDUFA4L2），HIGD2A在部分CIV上的占位，可能为这些异构体在特定情况下的快速替换预留了接口，从而精细调控CIV的活性以适应不同的代谢需求。

总之，这项工作不仅解答了呼吸体组装过程中一个长期存在的具体问题，更重要的是，它展示了一种通过占位符控制蛋白质复合物组装顺序和质量控制的普适性机制，为未来干预线粒体功能障碍相关疾病提供了新的潜在靶点和思路。