β-链配对靶向RFdiffusion技术显著提升亲水性蛋白靶点结合剂的设计能力

《Nature Communications》：Improved protein binder design using β-pairing targeted RFdiffusion

本研究针对亲水性蛋白靶点结合剂设计难题，开发了β-链配对靶向RFdiffusion新方法。研究人员通过界面条件化策略生成与目标边缘β-链形成几何匹配扩展β- sheet的蛋白支架，成功获得针对KIT、PDGFRα、ALK-2等7个靶点的皮摩尔级高亲和力结合剂。晶体结构验证显示设计模型与实验结构高度一致（RMSD 0.98 ?），突破性地扩展了计算蛋白设计靶向极性表面的能力。

　　

在生物医药领域，设计能够特异性结合靶标蛋白的分子工具和潜在疗法一直是科学家们追求的目标。尽管计算方法在蛋白设计方面取得了显著进展，但针对亲水性蛋白表面的高亲和力结合剂设计仍然面临严峻挑战。这类表面通常富含氢键供体和受体，需要设计精确互补的极性相互作用，而传统方法难以实现这种精确匹配。

许多具有重要治疗意义的靶标蛋白（如细胞表面受体）含有暴露的边缘β-链，这些结构通常具有非经典几何特征，可减少聚集倾向，但也为设计特异性结合剂提供了独特机会。如何针对这些不规则边缘β-链开发通用设计策略，成为该领域亟待解决的关键问题。

针对这一挑战，Baker实验室团队在《Nature Communications》上发表了创新性研究成果。他们开发了β-链配对靶向RFdiffusion方法，通过界面条件化策略引导蛋白生成过程，成功设计了针对七个不同靶点的高亲和力结合剂。该方法显著提高了设计成功率，获得的结合剂表现出优异的亲和力（pM至nM级）、特异性和稳定性，晶体结构验证证实了设计准确性。

关键技术方法

研究采用RFdiffusion深度学习模型进行蛋白骨架生成，通过界面条件化张量指定结合剂与目标β-链的配对关系。利用ProteinMPNN进行序列设计，AlphaFold 2进行结合预测评估。实验验证包括酵母表面展示筛选、表面等离子共振（SPR）测定亲和力、圆二色谱分析热稳定性、X射线晶体学解析复合物结构。功能实验涵盖内化检测、靶向降解和信号通路抑制分析。

β-链界面条件化改进结合剂设计

研究团队在RFdiffusion推理阶段提供界面条件化信息，指示结合剂β-链与目标边缘β-链配对。与仅使用热点条件化的方法相比，β-链界面条件化显著提高了设计成功率（9.2% vs 0.98%），并产生了更丰富的结构多样性。该方法对所有测试靶点均产生成功的硅内设计，而标准方法对两个靶点（ALK-3和FCRL5）未能产生成功设计。

设计模型与生物物理表征

针对七个靶点设计的结合剂均表现出高亲和力，解离常数（K_d）从皮摩尔到纳摩尔级不等。其中ALK-3bp亲和力最高（528 pM），PDGFRabp-7LBF为137 pM，其他结合剂亲和力在1.9 nM至96 nM之间。圆二色谱分析显示所有结合剂具有优异的热稳定性，熔化温度（T_m）在63.2°C至95°C以上，尽管含有暴露边缘β-链，但均表现出良好的溶液行为。

β-链配对结合剂界面具有靶标特异性

交叉结合实验证实了设计结合剂的高特异性。在1.5μM和200nM浓度下，所有结合剂仅对设计靶标产生强SPR响应，而对其他测试受体无明显结合。即使针对结构相似的靶标对（如ALK-2/ALK-3、KIT/PDGFRα），结合剂也表现出严格特异性，这源于不同β-链配对氢键阵列和额外的非链配对相互作用。

KITbp:KIT复合物结构验证设计准确性

KITbp与KIT结构域1-3的复合物晶体结构（2.8 ?分辨率）显示与计算设计模型高度一致，全原子RMSD为1.9 ?，骨架原子RMSD为0.98 ?。界面分析发现21个氢键，其中9个来自β-链配对相互作用，极性原子占链配对界面的65%。KITbp结合位点与KIT天然配体干细胞因子（SCF）重叠，饱和浓度SCF可减少99%的KIT库结合。

设计结合剂的生物学功能

功能实验表明设计结合剂具有生物学活性。FCRL5bp可被细胞内化，与EGFRbp融合后可诱导EGFR降解。PDGFRabp-7LBF能有效阻断PDGF-AA通过Akt和Erk通路的信号激活，对ERK磷酸化（IC₅₀= 19.6 nM）和AKT磷酸化（IC₅₀= 38.25 nM）具有纳摩尔级抑制能力。在伴隨研究中，a-CTXbp可有效中和a-CTX，保护小鼠免受致命神经毒素攻击。

研究结论与意义

本研究开发的β-链配对靶向RFdiffusion方法突破了亲水性蛋白表面结合剂设计的瓶颈。通过精确匹配目标边缘β-链的几何特征，成功设计了针对多个重要治疗靶点的高亲和力、高特异性结合剂。该方法的核心优势在于能够利用β-链配对有效互补极性表面的大量氢键供体和受体，相比主要依赖α-螺旋的设计策略具有明显优势。

设计的结合剂表现出卓越的特性：高热稳定性（T_m>95°C）、皮摩尔级亲和力、严格靶标特异性以及良好的溶液行为。晶体结构验证证实了设计方法的高精度，为计算方法可靠性提供了有力证据。功能实验证明这些结合剂在细胞环境中具有预期生物学活性，包括受体内化、靶向降解和信号通路抑制等。

该研究的成功证实了深度学习蛋白设计模型生成功能验证的β-链配对界面的能力，显著扩展了从头设计结合蛋白的结构多样性和可靶向表面范围。特别是对许多治疗相关靶点（如细胞表面受体的免疫球蛋白结构域）的开发具有重要价值，为新型治疗干预措施奠定了基础。尽管这些结合剂作为治疗分子可能需进一步优化，但作为起点为改善亲和力、稳定性、药代动力学等特性提供了优秀平台。

值得注意的是，天然蛋白边缘β-链的不规则几何特征可能具有抑制脱靶相互作用的功能，而本研究设计的高特异性结合剂支持了这一假设，并证明通过精确匹配目标几何特征，可以系统靶向天然蛋白的不规则边缘β-链。这一发现不仅具有重要应用价值，也为理解蛋白-蛋白相互作用的基本原理提供了新见解。