《Nature Communications》：Rad51 determines pathway usage in post-replication repair
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复制叉停滞后的修复通路如何“排班”一直成谜。UC Davis团队锁定酵母Rad51，发现E135D、K305N两突变大幅削弱其对dsDNA的亲和力，却保留ssDNA结合与D-loop活性，导致MMS诱导的 fork 保护失效、突变率飙升，并迫使细胞转向TLS与Rad51非依赖的模板转换。该工作首次直接证实Rad51-dsDNA相互作用是调控post-replication repair通路分配的核心“开关”，为解析BRCA1/2缺陷肿瘤对PARPi耐药机制提供新视角。
当DNA复制机遇上“路障”，细胞必须在“精准修复”与“快速绕过”之间做出抉择。若选择失误，基因组不稳定性与突变负荷将急剧攀升，驱动肿瘤发生与耐药。然而，调控这一命运决定的分子“交通灯”长期模糊不清：停滞复制叉究竟如何决定启用同源重组（HR）进行高保真模板转换，还是启用易错性的跨损伤合成（TLS）？Rad51作为HR核心酶，其经典功能被认为是结合单链DNA（ssDNA）形成核蛋白纤维，执行同源搜索与链侵入；但近年哺乳动物研究提示，Rad51还能保护新生DNA免受MRE11、EXO1、DNA2等核酸酶“误伤”，且该功能不依赖HR下游因子Rad54。令人费解的是，真核Rad51与细菌RecA最大区别之一在于其对双链DNA（dsDNA）具有显著亲和力，这一“额外技能”究竟为何演化而来？是否正是决定修复通路取向的“隐藏开关”？为回答上述问题，美国加州大学Davis分校Wolf-Dietrich Heyer团队在酿酒酵母中开展系统研究，相关成果发表于《Nature Communications》。
作者首先以rad51Δrad54ts双突变对甲基磺酸甲酯（MMS）极度敏感为背景，通过高拷贝质粒随机突变筛选，捕获两株能“逆袭”MMS敏感表型的Rad51突变体：Rad51-E135D（ED）与Rad51-K305N（KN）。将突变原位敲入基因组后，ED突变呈现与rad51Δ相当的MMS敏感性，KN则仅轻度敏感；两突变均无法再度抑制rad54Δ的敏感表型，提示其并非简单绕过Rad54，而是改变修复通路分配。
为揭示机制，作者整合多学科技术：生化层面，纯化野生型与突变蛋白，采用电泳迁移率变动（EMSA）、盐滴定STM、负染电镜及ATP酶测定，定量比较DNA结合与纤维形成；细胞生物学层面，利用免疫荧光、染色质内切酶切割（ChEC）与2D凝胶电镜，追踪Rad51在MMS阻滞叉上的招募及姐妹染色单体连接（SCJ）形成；遗传学层面，通过CAN1正向突变、iDamage单损伤整合及多位点表型互作，评估TLS与模板转换通路的相对贡献；体外重组体系，重建RPA-Rad51-Rad54介导的D-loop反应，评估链侵入活性；同时构建exo1Δ、mms2Δ、rev3Δ、pol30-K127R-K164R（KKRR）等背景，剖析通路交叉。
主要结果如下：
Rad51突变体分离与MMS敏感性验证
通过高拷贝抑制筛选获得ED与KN，二者在染色体水平均无法弥补rad54Δ，却使细胞对MMS表现出梯度敏感，提示复制叉修复失衡。
rad51-ED与rad51-KN在姐妹染色单体重组中基本正常
直接重复序列报告系统显示，两突变体自发与HO诱导的姐妹染色单体基因转换频率与野生型无显著差异，亦不能恢复rad54Δ的缺陷，表明短程HR未受明显影响。
rad51-ED与rad51-KN在全基因组同源搜索中严重受损
D-loop捕获（DLC）与断裂诱导复制（BIR）实验显示，ED与KN在染色体V-XI间形成D-loop及BIR产物效率分别下降5-10倍，提示长程纤维或基因组尺度搜索受阻。
Rad51-ED与Rad51-KN蛋白对dsDNA结合显著减弱
EMSA与STM显示，野生型Rad51对100bp dsDNA的Kd≈500nM，而两突变体在100mM NaCl下几乎无法形成稳定复合物；电镜亦显示其在1kb dsDNA上形成>200nm长纤维的能力下降≥70%，但对ssDNA亲和力仅轻度降低。
Rad51-ED与Rad51-KN ATP酶活性降低但仍能完成D-loop
在200mM NaCl条件下，ED与KN水解ATP速率下降30-50%，与dsDNA结合缺陷一致；然而，在50-100mM NaCl的D-loop重建实验中，二者在Rad54辅助下生成D-loop的峰值与野生型相当，说明催化链侵入的核心功能仍保留。
Rad51-ED与Rad51-KN丧失保护dsDNA免受核酸酶降解的能力
体外降解实验显示，野生型Rad51可抑制Exo1及Sgs1-Dna2对100bp dsDNA的切割≥80%，而ED与KN在4μM浓度下几乎无保护作用，直接证实dsDNA结合是“盾牌”功能的基础。
rad51-ED与rad51-KN与TLS及模板转换突变体呈现协同敏感
在0.0033%MMS下，ED与rev3Δ、 mms2Δ或pol30-KKRR组合表现出“雪上加霜”的生长缺陷，KN虽单突变耐受，但与上述突变组合亦显著增敏，提示突变体已将修复负荷强制转向TLS与PCNA-多泛素化依赖的模板转换（推测为叉倒退）。
rad51-ED与rad51-KN显著提高自发突变率
CAN1检测显示，ED与KN分别使突变率上升9倍与6倍，与rad51Δ、rad54Δ处于同一水平，且依赖Rev3，证明TLS被过度征用。
iDamage单损伤整合揭示TLS比例升高、模板转换下降
在TT(6-4)光产物与N2-dG-AAF损伤模型中，野生型TLS占比约5-17%，模板转换（DA）为余量；rad51Δ使TLS翻倍，ED与KN表现相同趋势，进一步量化证明通路切换。
Rad51-ED严重削弱在MMS阻滞叉上的招募与SCJ形成
ChEC显示，ED-MN融合蛋白在0.05%MMS处理2h后几乎不切割基因组DNA，KN-MN切割水平与野生型一致；2D凝胶定量则表明，ED使sgs1Δ背景SCJ积累降至20%，KN降至60%，直接说明dsDNA结合缺陷导致Rad51无法有效锚定并稳定停滞叉。
综上，作者提出“Rad51-dsDNA结合是复制叉修复通路分配开关”的新模型：真核Rad51通过高亲和力结合dsDNA，在ssDNA-dsDNA交界处或叉倒退结构形成“护DNA盾”，阻止Exo1、Dna2-Sgs1等核酸酶过度修剪；一旦该功能因E135D、K305N等突变丧失，复制叉稳定性下降，长程HR纤维难以延伸，细胞被迫调用TLS及Rad5介导的叉倒退通路，虽可解燃眉之急，却伴随突变负荷显著增加。该发现不仅解释了真核Rad51为何保留强dsDNA结合能力这一进化谜题，也为理解BRCA1/2缺失、RAD51-S181P等临床突变导致基因组不稳定与PARP抑制剂耐药提供了机制线索，提示靶向Rad51-dsDNA界面或调控其纤维长度可能成为增强肿瘤化疗敏感性、降低获得性突变的新策略。
